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MICROSCOPIE

La révolution qui consiste, à la fin du XVI^e siècle, à regarder «à la loupe» non plus directement un objet, mais son image agrandie est à l’origine de la microscopie. L’étymologie (du grec mikros , petit, et skopein , examiner) renvoie à l’examen d’objets ou de détails d’objets à peine perceptibles ou invisibles à l’œil nu. La microscopie s’est ensuite progressivement imposée comme une technique d’observation indispensable pour accéder aux propriétés de la matière, inanimée ou vivante.

En introduisant de nouveaux modes d’observation et grâce à une perception de plus en plus fine, jusqu’à l’échelle atomique, la microscopie a ainsi bouleversé notre culture scientifique (fig. 1). Dans le seul domaine de la biologie, les illustrations sont nombreuses: c’est un microscope que Pasteur utilise pour découvrir les micro-organismes de la fermentation et en suivre l’évolution. L’importance de la microscopie optique dans les sciences de la vie à la fin du XIX^e siècle s’est encore confirmée au cours du XX^e siècle grâce à de nouveaux microscopes. Toujours dans ce domaine, c’est la microscopie électronique qui a permis de progresser rapidement dans l’étude des ultrastructures.

Le mode de production des images, leurs supports physiques, la nature et le traitement de l’information qu’elles contiennent ont conditionné l’évolution de la microscopie. L’image d’un objet résulte de la saisie d’informations caractéristiques de l’objet (forme, contour, couleur, etc.). Ces informations sont véhiculées par un rayonnement qui interagit avec l’objet. La production d’images par les microscopes traditionnels suppose donc:

– une source de rayonnement et un dispositif d’éclairage de l’objet;

– une optique de transmission assurant la fonction d’agrandissement,

– un détecteur traduisant l’image sur un support (œil, plaque photographique, écran d’ordinateur pour des images numérisées);

L’image obtenue est généralement soumise à l’analyse et à l’interprétation du cerveau.

Par sa nature, le rayonnement détermine l’interaction avec l’objet. On distingue en particulier les objets d’amplitude et les objets de phase selon la caractéristique de l’interaction rayonnement-matière mise en jeu. L’interprétation de l’image fait donc appel à une connaissance précise des interactions rayonnement-matière.

Par sa longueur d’onde, le rayonnement détermine la limite théorique des détails perceptibles sur l’image. Cette limite est imposée par les phénomènes de diffraction (critère de Rayleigh). En outre, la résolution dépend aussi, de façon cruciale, de la construction de l’ensemble qui véhicule l’information depuis l’objet jusqu’au support d’image.

La classification des microscopes traditionnels repose sur la nature du rayonnement. On distingue la microscopie optique (ou photonique ), qui utilise les radiations électromagnétiques du spectre visible ou encore les radiations infrarouges ou ultraviolettes proches du visible et même des rayons X, de la microscopie électronique , qui, elle, utilise les propriétés ondulatoires de faisceaux d’électrons accélérés (cf. ONDES - Physique), auxquels peut être associée une courte longueur d’onde; elle atteint ainsi des résolutions bien meilleures que la microscopie optique.

Dans ces microscopies traditionnelles, les distances séparant la source de rayonnement de l’objet et du détecteur sont grandes par rapport à la longueur d’onde du rayonnement; on est en régime de propagation ou de champ lointain .

Beaucoup plus récente, la microscopie de champ proche s’est rapidement développée à partir des succès du microscope par effet tunnel dans les années 1980. Ici, l’information est saisie à la source même de sa production. La distance objet-détecteur (souvent quelques distances atomiques ou quelques nanomètres) est faible par rapport à la longueur d’onde du rayonnement, ou par rapport à la portée de l’interaction entre détecteur et objet. La propagation n’intervient donc pas, ce qui élimine les problèmes d’optique de transmission et les limitations de performance qu’ils entraînent. L’image possède donc une résolution exceptionnelle fixée par la taille utile du détecteur.

Enfin, il paraît indispensable de souligner l’importance des échanges continuels entre théorie et expérience afin de comprendre l’évolution historique des techniques de microscopie.

La caractérisation par microscopie est particulièrement adaptée aux sciences expérimentales telles que la physique, la chimie, la pétrologie et la biologie. La démarche du biologiste vise à identifier les relations entre structures et fonctions au sein des organismes vivants. Aux différentes échelles de résolution, la connaissance de la structure est une clé de compréhension des mécanismes qui concourent à une fonction. L’approche méthodologique du biologiste privilégie donc l’étude des composants élémentaires des organismes vivants et celle de leurs interactions. Le physicien cherche, lui, à établir des relations entre la structure et les propriétés physico-chimiques des matériaux. Les images de microscopie entrent ainsi pour beaucoup dans les représentations d’un monde invisible à nos yeux et dans notre compréhension des processus à l’échelle microscopique. Ces approches scientifiques sont de nos jours facilitées par les procédés d’analyse d’images et de reconnaissance de formes. Technique instrumentale au départ, la microscopie se développe sous des formes nouvelles en s’appuyant sur les avancées de la technologie et de la science. En jetant les bases de l’optique électronique, les physiciens ont en effet entièrement conçu le microscope électronique par analogie avec le microscope photonique classique. Les modes d’observation couramment pratiqués en microscopie optique dans le but d’améliorer la détection des détails (fond clair et fond noir) et les modes de correction des aberrations de l’optique (sphéricité, stigmatisme, chromatisme) ont directement inspiré la microscopie électronique. L’excellente résolution du microscope électronique a permis à son tour d’affiner notre connaissance de la matière à l’échelle atomique et d’accéder à des analyses quantitatives d’une extrême précision (micro-analyse). Par la suite, la facilité de construction de sources d’électrons peu étendues et brillantes, ainsi que le balayage de faisceaux d’électrons très focalisés ont permis la naissance de la microscopie électronique à balayage . Cette notion de balayage avec acquisition successive des points de l’image est maintenant transposée à la microscopie photonique, dite microscopie confocale à balayage laser . Cette innovation récente résulte de l’association de techniques de pointe en optique, en micromécanique et en micro-informatique. La microscopie confocale permet d’effectuer des prises de vue tridimensionnelles d’objets épais.

Enfin, à l’échelle atomique, la microscopie ionique de champ , qui a permis de «voir» les atomes pour la première fois, est une utilisation indirecte du phénomène quantique d’effet tunnel . C’est aussi l’effet tunnel que l’on retrouve à la base du fonctionnement d’un microscope à balayage. Son principe, ses performances et sa configuration favorisent le renouveau d’une notion familière à l’optique, celle de champ proche.

1. Microscopie photonique ou optique

C’est probablement la vision de l’univers lointain et la mise au point des premières lunettes d’astronomie qui ont permis l’invention des premiers microscopes: l’objectif donne une image agrandie de l’objet, et l’oculaire sert, lui, à examiner l’image intermédiaire.

Du point de vue de l’instrumentation, un des avantages de cette configuration est de dissocier les contraintes de fabrication. L’objectif possède une courte distance focale, donc une forte convergence, et un petit diamètre. L’oculaire possède quant à lui une moindre convergence.

Depuis l’invention du premier microscope optique (1690) attribuée au Hollandais Leeuwenhoek et par certains à son prédécesseur, Zacharias Jansen, la microscopie se développe continuellement; les progrès les plus importants au cours du XX^e siècle concernent l’application des phénomènes d’interférence et de contraste de phase , qui rendent possible l’examen d’objets parfaitement transparents, ne différant de leur milieu que par de très petites variations d’épaisseur ou d’indice de réfraction, et la microscopie de fluorescence qui permet de détecter la lumière de fluorescence émise par une préparation biologique convenablement illuminée. Les objets parfaitement transparents examinés en mode de fluorescence sont alors repérés par le rayonnement qu’ils émettent sous l’effet d’un rayonnement excitateur ^{[cf. LUMINESCENCE]}. Ce nouveau mode de contraste, développé au cours des années 1960, permet l’observation de la fluorescence intrinsèque à l’échantillon, ou encore d’anticorps couplés à une molécule fluorescente capable de reconnaître une structure cellulaire ou tissulaire spécifique et de s’y fixer. Il s’agit alors respectivement d’immunocytochimie et d’immunohistochimie.

En complément de la microscopie photonique classique, qui est une microscopie plein champ , c’est-à-dire où l’ensemble de la préparation est totalement éclairé, la microscopie confocale , d’origine très récente, procède au balayage d’un point lumineux focalisé pour couvrir la totalité du champ. Ce mode d’observation confocal offre l’avantage d’éliminer totalement la lumière qui ne provient pas du plan de mise au point optique. Les images correspondent alors à des coupes optiques de faible épaisseur (moins de 1 micromètre). Cela permet une reconstruction en trois dimensions d’objets marqués en fluorescence, technique désormais exploitée en science des matériaux et en biologie.

On examinera d’abord les caractéristiques optiques du microscope photonique, qui déterminent la dimension de l’image vis-à-vis de l’objet (grossissement , grandissement ), sa luminosité (clarté ), ainsi que la largeur et la profondeur de l’espace où l’objet est observable nettement. La qualité deux images sera déterminée par la qualité des optiques, les défauts usuels tels que les aberrations géométriques et chromatiques devant être soigneusement compensés afin d’éviter la distorsion des images ou le flou. On donnera ensuite quelques indications sur la construction des pièces optiques et mécaniques et sur les divers modes d’éclairage possibles (fond clair, fond noir, lumière ultraviolette, lumière polarisée, etc.).

Caractéristiques des microscopes optiques

Les améliorations successives du système de lentilles et de la partie mécanique du microscope à optique photonique ont fait de celui-ci un instrument de grande précision, robuste et facile à utiliser. Parallèlement à ces améliorations de l’appareil, les techniques de préparation des objets à observer se sont perfectionnées, et l’on a vu le microscope optique devenir un instrument indispensable dans de très nombreux laboratoires, où il est utilisé aussi bien pour des travaux de recherche fondamentale ou appliquée que pour des travaux de simple routine.

Mise au point

Considérons le «microscope réduit» de la figure 2. L’objectif et l’oculaire sont assimilés respectivement à des lentilles simples L¹ et L². L’objectif fournit d’un objet, tel que AB, une image agrandie A¹B¹ dont l’oculaire forme l’image (le plus souvent rejetée à l’infini), qui est perçue par l’œil. Elle est renversée, ce qui ne présente pas d’inconvénient.

Le diamètre de l’objectif L¹ et sa longueur focale f ¹ sont très petits (de l’ordre de quelques millimètres); sa face d’entrée est parfois plongée, de même que l’objet, dans un liquide d’indice de réfraction n 礪 1 (immersion ). L’oculaire a un diamètre et une longueur focale f ² de l’ordre de quelques centimètres. La distance du foyer image F ¹ de l’objectif au foyer objet ² de l’oculaire est de l’ordre de 20 cm. Pour que l’image intermédiaire A¹B¹ soit réelle et agrandie, l’objet doit être en deçà de ¹ (par rapport au sens de propagation de la lumière). L’image A B est à l’infini.

La mise au point s’effectue en faisant varier la distance séparant l’objet (préparation) du système objectif-oculaire. Dans le cas où l’image A B est à l’infini, on dit que le fonctionnement du microscope est «normal» (l’observateur utilisant un verre correcteur, s’il en a besoin).

Si l’on veut obtenir une microphotographie, on place après l’oculaire un objectif photographique qui forme sur l’émulsion placée dans son plan focal une image réelle. Les divers organes sont portés par une monture mécanique (statif du microscope) assurant la stabilité et pourvue des dispositifs permettant le réglage (crémaillère, micromètres). Divers objectifs et oculaires peuvent être utilisés sur le même statif.

On appelle distance frontale celle qui sépare l’objet de la face d’entrée de l’objectif. Elle est généralement petite ou très petite (entre 20 et 0,2 mm). Les objets examinés peuvent être inclus dans des préparations qu’on observe par transparence: coupes très minces de tissus animaux ou végétaux, moulages de surfaces solides (répliques ) ou encore gouttes liquides étalées entre deux lames de verre dites porte-objet et couvre-objet. L’objet peut aussi être constitué par un corps opaque, observé par réflexion, ou un corps fluorescent observé grâce à des filtres appropriés.

Grandissement, grossissement

Soit y et y les dimensions transversales de l’objet AB et de son image. En microscopie photographique, une caractéristique essentielle du microscope est le grandissement (linéaire) g = y /y.

En microscopie visuelle, ce qui importe est l’angle sous lequel on voit dans l’instrument l’image A B , qu’elle soit ou non située à l’infini (fig. 2). On le compare à l’angle , qui n’apparaît pas sur le schéma, sous lequel l’œil nu verrait AB à la distance conventionnelle 益 = 250 mm, et l’on appelle grossissement le rapport:

l’angle étant petit.

Dans le cas du fonctionnement normal, on démontre que ce grossissement a une valeur de l’ordre de: G = 500.

L’image intermédiaire A¹B¹ permet de décomposer le grandissement G en deux termes:

Soient g ¹ le grandissement de l’objectif et G ² le grossissement de l’oculaire. Pour chaque combinaison, on calcule G d’après les valeurs de g ¹ et de G ² indiquées par les constructeurs.

À chaque objectif correspond, comme on le verra, un grossissement limite qu’il peut être désavantageux de dépasser.

Limite de résolution et ouverture numérique

Il existe toujours une valeur du grossissement au-delà de laquelle la perception des détails n’est plus améliorée. Celle-ci est limitée parce que l’image d’un point objet n’est jamais rigoureusement ponctuelle en raison des aberrations et des phénomènes de diffraction qui doivent être pris en considération pour des détails avoisinant la longueur d’onde de la lumière utilisée (cf. LUMIÈRE - Diffraction). De ce point de vue, la qualité des optiques dépend principalement de l’ouverture numérique O ⁿ qui caractérise le demi-angle maximal 見 sous lequel l’objet immergé dans un milieu d’indice n peut être observé par l’objectif:

Suivant le critère de lord Rayleigh, on démontre que la distance transversale minimale s de deux points, dont l’objectif donne des images distinctes (limite de séparation) a pour valeur, du fait de la diffraction:

En lumière blanche, on peut prendre pour la valeur dominante 0,55 猪m. D’où, si O ⁿ = 0,5, s = 0,66 猪m. Il convient donc d’augmenter O ⁿ si l’on veut améliorer la résolution latérale intrinsèque du microscope. Cela nécessite un fort indice de réfraction n et un grand angle d’ouverture 見.

L’œil n’étant lui-même apte à distinguer deux points voisins que si leur écart angulaire dépasse un certain minimum 靖 (limite de séparation oculaire ), il ne profitera pleinement du pouvoir séparateur de l’objectif que si l’on associe à celui-ci un oculaire tel que le grossissement de l’ensemble atteigne la valeur G ^s = 250 靖 /s ; 靖 est exprimé en radians et s en millimètres. Pour de grandes valeurs de G , la clarté et la profondeur de champ diminuent. D’ailleurs, 靖 , qui dépend de l’observateur, décroît avec la luminance et le contraste de l’image. La perception des détails devient donc moins bonne au-delà d’une valeur dite optimale 靖 du grossissement G .

Le grossissement optimal doit donc être recherché expérimentalement à l’aide d’objets tests à structure fine; il dépasse rarement 1 000 fois l’ouverture numérique (lumière visible). L’emploi des radiations ultraviolettes permettrait d’abaisser s à 0,1 猪m, à condition de conserver la qualité optique du microscope.

La résolution verticale , plus couramment dénommée profondeur de champ est la plus grande distance d , comptée suivant l’axe optique, pour laquelle la netteté des détails perçus dans l’espace objet reste acceptable. De façon analogue à la définition de la résolution latérale, on ne perçoit nettement, dans un objet transparent, qu’une région dont l’épaisseur d est d’autant plus petite que l’ouverture numérique O ⁿ est plus grande. Lorsque d est réduite à une fraction de micromètre, on dit alors que le microscope réalise une «coupe optique» dans l’objet, bien qu’un rayonnement lumineux défocalisé provenant des coupes adjacentes soit malgré tout transmis à l’observateur. La perception des détails en profondeur dépend beaucoup de la transparence et de la finesse de l’objet considéré.

La latitude de mise au point est naturellement égale à la profondeur de champ puisqu’on déplace le système optique du microscope par rapport à l’objet. Ce déplacement doit donc être réglé avec une très grande sensibilité (mouvement micrométrique) et maintenu ensuite constant. Si l’on vise successivement deux points A⁰ et A, le déplacement du microscope permet de mesurer la distance A⁰A avec une très grande précision.

Descriptif mécanique et optique

Partie mécanique

La partie mécanique d’un microscope (statif et organes accessoires) doit constituer, d’après ce que l’on a indiqué, un ensemble très solide, et ses mouvements doivent avoir une grande précision. Elle comporte, sous sa forme «ancienne», un tube métallique, généralement vertical. Les objectifs sont fixés à la partie inférieure, les oculaires se posent à la partie supérieure.

Au-dessous du tube, une platine percée d’un trou pour les observations par transmission reçoit la préparation qui peut être déplacée latéralement. Pour la mise au point, la distance entre l’objectif et l’objet est réglable par un mouvement rapide de grande amplitude et un mouvement lent (micrométrique) de faible amplitude commandés respectivement par deux boutons concentriques. L’ensemble du microscope est fixé sur un pied assez lourd et peut parfois être incliné par rotation autour d’un axe horizontal.

Beaucoup d’instruments modernes ont un statif d’aspect assez différent de ce qui vient d’être indiqué. Celui que représente schématiquement la figure 3 (microscope optique actuel) comporte deux sources de lumière incorporées, de nombreux modes de contraste, un tube binoculaire et un boîtier de photographie. La substitution d’un objectif à un autre s’obtient par l’emploi d’une tourelle à revolver. Ce type de microscope permet l’observation visuelle binoculaire et la microphotographie, ainsi que, par remplacement de certaines pièces optiques et mécaniques, l’utilisation des divers éclairages par transmission ou par réflexion. Dans l’éclairage par transmission, la lumière est concentrée sur la préparation par un dispositif optique, appelé condenseur , muni d’un diaphragme à iris. La seconde source permet l’éclairage par réflexion et l’éclairage de fluorescence qui seront considérés plus loin.

Objectifs et oculaires

Les objectifs doivent, en utilisant un faisceau généralement très ouvert de lumière blanche ou éventuellement colorée, former une bonne image du foyer objet du microscope et des points qui l’entourent (situés dans le plan objet). Ils satisfont ainsi à la condition d’aplanétisme d’Abbe . Les objectifs doivent en outre être achromatiques , c’est-à-dire former sensiblement les mêmes images pour toutes les longueurs d’onde du spectre visible. Les objectifs, composés de plusieurs lentilles, sont conçus après des calculs informatiques très complexes et doivent être construits avec grand soin pour que les aberrations des images qu’ils donnent (écarts avec les images idéales) soient réduites au minimum.

Si l’objet doit être couvert par une lamelle qui introduit une certaine aberration, l’objectif est calculé pour compenser cette dernière; l’épaisseur de la lamelle qui convient à l’objectif est par suite imposée (0,17 mm en général). Ainsi, des objectifs de grandissement et d’ouverture numérique différents sont utilisés. Pour les objectifs travaillant «à sec», la face d’entrée est dans l’air (n = 1). Pour les objectifs à immersion, l’objet est relié optiquement à l’objectif par une goutte d’huile (n = 1,515), et l’ouverture numérique est plus grande, jusqu’à 1,4.

On utilise quelquefois des objectifs à miroirs; ils donnent une même image pour toutes les longueurs d’onde et ont, en outre, l’avantage d’une grande distance frontale, mais leur construction est particulièrement difficile en raison du centrage délicat. La présence d’un orifice central diminue la qualité de l’image, ce qui limite l’emploi de ce type d’optique.

Les oculaires sont du type Huygens pour les microscopes simples. Ils comportent deux lentilles plan-convexes de même verre entre lesquelles se situe leur foyer objet. À fort grossissement ou pour des champs étendus, on a recours à des combinaisons plus complexes, spécialement adaptées à chaque type donné d’objectif, dont ils réduisent les aberrations résiduelles. On peut remarquer sur le schéma de la figure 2 que les oculaires sont traversés par des faisceaux assez fortement inclinés sur l’axe, mais peu ouverts; ils travaillent donc dans des conditions très différentes des objectifs.

On introduit assez souvent entre l’objectif et l’oculaire des systèmes dits véhiculaires, transportant l’image intermédiaire et permettant notamment une variation par paliers ou même continue (zoom) du grandissement.

Microscopes binoculaires

La majorité des microscopes classiques est équipée d’une «tête binoculaire». Le faisceau qui sort de l’objectif est divisé en deux par un miroir semi-transparent. On rend ainsi les observations moins fatigantes, mais, les deux images observées étant identiques, la sensation du relief est purement subjective.

En revanche, les microscopes stéréoscopiques, qui comportent deux microscopes identiques jumelés dont les axes convergent sous un angle faible vers un même point de la préparation, permettent, par fusionnement des images perçues par les deux yeux, d’obtenir une véritable observation stéréoscopique.

L’écartement des axes au niveau des yeux doit être celui de leurs pupilles (de l’ordre de 65 mm, il est réglable selon l’observateur). Les contraintes de réalisation de deux axes optiques proches limitent l’ouverture numérique à 0,1 environ, le grossissement utile ne dépasse alors guère 100. L’image visuelle doit apparaître non inversée, faute de quoi la stéréoscopie est faussée. À cet effet, on introduit les inverseurs à prismes sur chaque faisceau. Ces microscopes stéréoscopiques sont utilisés lors d’opérations de microchirurgie.

Modes d’éclairage simples et utilisations

Au microscope optique classique sont venus s’adjoindre plusieurs dispositifs tels que la polarisation, le contraste de phase, le contraste interférentiel, la fluorescence, etc., qui ont considérablement élargi le champ d’utilisation de cet instrument. Ces modes d’éclairage diffèrent suivant que les objets sont transparents ou opaques; les premiers peuvent être observés par transmission, les seconds en lumière réfléchie seulement.

Éclairage par transmission (fond clair)

Dans sa version la plus simple, le microscope optique à fond clair est utilisé dans de nombreuses branches de la biologie dont les principales sont l’histologie, la cytologie, la parasitologie, la microbiologie et la numération d’éléments figurés microscopiques. On envoie sur la préparation à travers le condenseur un faisceau lumineux centré suivant le principe de l’éclairage de Köhler (fig. 4). Les rayons pénètrent dans l’objectif après avoir subi l’influence de l’objet qui, en général, diffracte la lumière qui le traverse. L’objectif recueille cette lumière diffractée.

L’éclairage de Köhler, très couramment utilisé, est un mode opératoire dans lequel, au lieu de former sur la préparation une image de la source Q, on projette celle-ci à l’aide d’un collecteur sur la pupille d’entrée (F^C) du condenseur L^C, l’objet se trouvant ainsi éclairé d’une manière uniforme, indépendamment de la structure de la source (filament). Un diaphragme (iris) positionné en D¹ limite la pupille du condenseur, tandis que l’image D² du diaphragme de champ fixé sur la lampe est projetée par le condenseur sur l’objet en D ². Cela permet de limiter la surface éclairée du diaphragme de champ et a pour effet d’éliminer la lumière parasite. Suivant ce schéma général de l’éclairage de Köhler, on distingue plusieurs réalisations de condenseurs en fonction de l’ouverture du faisceau d’éclairage.

L’éclairage monochromatique en fond clair (ou plus simplement à spectre partiellement filtré) peut faire apparaître sur une préparation des détails qui absorbent sélectivement cette lumière, alors que le contraste en lumière blanche reste faible. À titre d’exemple, l’hémoglobine absorbe spécifiquement et intensément dans la bande de Soret ( = 415 nm) que l’on extrait d’une lumière blanche à travers des filtres en verre dits interférentiels. Dans une préparation observée avec un microscope optique classique éclairé avec une lumière dont la longueur d’onde varie entre 400 et 420 nm, les pigments hémoglobiniques apparaîtront en gris ou en noir selon leur concentration (fig. 5 a).

Applications de l’éclairage par transmission en fond clair

La plupart des tissus vivants observés tels quels au microscope optique classique ne présentent que très peu de contraste et peu de détails. On a donc été amené en histologie à fixer les tissus vivants et à les inclure dans des matières assez dures de façon à effectuer des coupes fines, de l’ordre de quelques micromètres d’épaisseur. Ces coupes sont traitées par des mélanges de colorants histologiques qui colorent différemment les diverses structures. Certaines colorations sont utilisées pour déterminer la nature chimique des éléments colorés (histochimie). L’examen des coupes histologiques permet d’étudier la structure des tissus et des cellules et de suivre les modifications physiologiques, expérimentales ou pathologiques de ces structures (cf. TISSUS - Histologie).

En cytologie, lorsque les tissus étudiés sont formés de cellules en suspension (par exemple, le sang) ou de cellules mobiles (par exemple, les ganglions lymphatiques, la rate), on peut pratiquer la technique des frottis (étalements ou empreintes d’organes) dont le but est d’obtenir des cellules étalées dans un plan en couche monocellulaire sur une lame de verre. Les techniques de fixation et de coloration sont très rapides. Toute la cellule aplatie sur la lame de verre est visible en même temps. La préparation est très mince, et on peut observer (fig. 5 b) de nombreux détails ^{[cf. HÉMATOLOGIE]}. En contrepartie, les cellules subissent une importante déformation, et seuls quelques tissus se prêtent à la technique des frottis.

Le microscope optique classique est aussi très utilisé en parasitologie et en microbiologie. Les prélèvements sont étalés sur une lame de verre, fixés puis colorés. En se fondant sur leur morphologie et sur leur capacité de fixer certains colorants, on peut généralement identifier les micro-organismes contenus dans une préparation (cf. MICROBIOLOGIE, PARASITOLOGIE).

Il est possible de déterminer la concentration d’éléments figurés microscopiques en suspension dans un liquide: par exemple, le nombre d’hématies dans 1 mm³ de sang. Une dilution de cette suspension est déposée dans une petite cavité creusée dans une lame spéciale (cellule à numération), dont le fond est divisé en petits carrés par gravure sur verre; les éléments figurés se déposent à peu près uniformément sur le fond de la cavité. À partir du nombre moyen d’éléments figurés déposés sur un carré et déterminés par un examen microscopique, il est possible par un calcul simple de trouver la concentration initiale dans la suspension ^{[cf. SANG]}.

Les applications médicales du microscope optique classique sont multiples; en effet, le diagnostic de nombreuses maladies est fait à partir de l’observation des coupes histologiques de tissus pathologiques ou de frottis de sang, d’épanchements séreux ou de sécrétions contenant des cellules desquamées.

Éclairage par transmission en fond noir ou ultramicroscopie

Les objets dont toutes les dimensions sont inférieures à la limite de résolution ne se voient pratiquement pas en éclairage à fond clair. Mais l’existence de ces objets «ultramicroscopiques» peut être perçue en mettant à profit la diffraction.

Dans le microscope à fond noir, ou ultramicroscope, seul le condenseur est différent de celui du microscope optique classique (fig. 6). Ce condenseur assure un éclairage très oblique de la préparation de telle façon que le faisceau de lumière incident ne pénètre pas dans l’objectif. Seuls les rayons diffractés par l’objet peuvent pénétrer dans l’objectif. Dans ces conditions, l’objet apparaît brillant sur un fond noir, mais sa forme ne peut être analysée par ce procédé. Cette technique, très utilisée autrefois pour visualiser de très petites particules en suspension dans un liquide, permet de voir des objets dont la taille est inférieure au pouvoir de résolution du microscope, d’où le nom d’ultramicroscope donné à cet appareil.

Les applications actuelles du microscope à fond noir sont restreintes, puisque cet appareil a été remplacé avantageusement par les microscopes à contraste de phase ou de contraste interférentiel. On utilise encore quelquefois le microscope à fond noir pour observer de très petits objets ayant peu de contraste: tréponèmes, flagelles bactériens, etc.

Éclairages spéciaux pour l’observation d’objets transparents

La microscopie à contraste de phase , à contraste interférentiel et l’utilisation de la lumière polarisée permettent de renforcer les contrastes observés ou même d’en faire apparaître de nouveaux, en noir ou en couleurs, dans le cas de certains objets transparents ou opaques-réfléchissants. Il en est résulté, depuis 1950, une véritable révolution en microscopie.

Microscopie à contraste de phase

Parmi les divers perfectionnements du microscope photonique classique, le dispositif qui utilise le contraste de phase est certainement celui qui a fait le plus progresser les connaissances sur la physiologie cellulaire. La matière vivante observée au microscope optique à fond clair ne présente que très peu de contraste, puisque seuls apparaissent les contours des objets et quelques organites plus denses qui absorbent une partie de la lumière. La plupart des structures cellulaires qui n’absorbent pas la lumière sont invisibles bien qu’elles modifient l’onde lumineuse qui les traverse en créant un retard de phase par rapport aux rayons lumineux qui ne traversent pas ces structures. Le microscope à contraste de phase transforme ce retard de phase invisible à l’œil, en différence d’intensité lumineuse que l’œil perçoit très bien.

Le principe du contraste de phase est exposé dans l’article LUMIÈRE - Diffraction. Le schéma de la figure 7 représente un microscope à contraste de phase. La lumière traverse d’abord l’ouverture annulaire D d’un diaphragme situé dans le plan focal du condenseur, le faisceau en cône creux traverse la préparation et est intercepté par la lame de phase annulaire L, qui doit coïncider avec l’image du plan D formée par l’ensemble condenseur-objectif, mais il existe aussi de la lumière à l’intérieur du cône creux: c’est de la lumière diffractée par les détails de l’objet et qui passe par toute l’ouverture de l’objectif (en majorité en dehors de l’anneau de phase). Suivant la théorie de Frederik Zernike (1932), on obtient ainsi des images très contrastées des objets dits «de phase» complètement invisibles en éclairage à fond clair.

L’une des applications du microscope à contraste de phase est l’observation des cellules vivantes. Il est nécessaire que les préparations ne soient pas très épaisses afin que les structures ne se superposent pas, ce qui rendrait l’image difficile à interpréter. De très bonnes conditions d’observation sont réalisées avec des cellules en suspension, mises entre deux lames de verre distantes de quelques micromètres. De nombreuses cellules peuvent survivre ainsi pendant une heure environ, et il est possible de suivre leur évolution. Ce type de préparation convient pour les cellules libres, telles que les cellules sanguines ou les cellules d’organes à structure lâche (ganglions lymphatiques, rate, moelle osseuse hématopoïétique). Pour les observations de plus longue durée, il faut avoir recours aux techniques de culture de tissus; les cellules s’étalent sur le support de la culture et peuvent ainsi être observées dans de bonnes conditions en microscopie en contraste de phase.

Microscopie à contraste interférentiel

Dans ces microscopes, le contraste de l’image est obtenu par interférence entre deux faisceaux lumineux issus d’une même source. Ces deux faisceaux interagissent différemment avec l’objet avant d’être superposés et d’interférer au nivaux de l’image agrandie.

Ce type d’appareil présente un double avantage: d’une part, il augmente le contraste des objets qui, en fond clair, sont très peu contrastés; d’autre part, il permet de réaliser des mesures précises de l’épaisseur des objets et de leur indice de réfraction.

Les principes généraux de la microscopie interférentielle sont exposés dans l’article INTERFÉRENCES LUMINEUSES. Il faut distinguer trois types principaux de microscopes interférentiels:

– ceux qui utilisent le schéma classique des interféromètres à deux ondes complètement séparées véhiculées par deux microscopes couplés;

– ceux qui mettent en œuvre l’interférence entre deux ondes qui traversent l’objet (ou se réfléchissent sur lui), décalées latéralement d’une distance de l’ordre de 1/20 à 1/3 du diamètre du champ objet. Ces micro-interféromètres sont plus faciles à construire et à régler que les précédents, mais leurs images sont parfois plus difficiles à interpréter à cause de leur chevauchement (cf. OPTIQUE CRISTALLINE, INTERFÉRENCES LUMINEUSES);

– ceux qui donnent le profil optique différentiel de l’objet (proportionnel à la première dérivée du profil normal). Ces microscopes utilisent deux éléments biréfringents (prismes) associés au condenseur et à l’objectif (cf. l’exemple de la figure 8). Dans le cas d’objets réfléchissants, il n’y a qu’un prisme derrière l’objectif. Ce type de microscope à contraste «interférentiel différentiel» permet un examen qualitatif, de grande sensibilité, dans presque tous les cas d’objets de phase ^{[cf. LUMIÈRE - Diffraction]}. Même des objets colorés (objets d’amplitude) sont observables en contraste interférentiel de ce type avec comme avantage une nette amélioration de la résolution. La microscopie à contraste interférentiel différentiel fournit ainsi des images d’excellente qualité, comparables à celles des microscopes à contraste de phase. Les mêmes structures d’objets biologiques sont retrouvées, mais avec des aspects différents. Le contraste interférentiel donne en général des images plus précises de différents plans de coupes à travers les échantillons cellulaires que le microscope à contraste de phase. En outre, il permet une observation convenable de structures très réfringentes et d’objets relativement épais, ce qui n’est pas possible avec le contraste de phase en raison des halos clairs qui entourent toutes les structures et dont la superposition dans les préparations assez épaisses masque de nombreux détails. Les deux techniques – contraste de phase et contraste interférentiel différentiel – se complètent fort utilement.

Éclairages par réflexion de type métallographique

L’éclairage des objets opaques étudiés en science des matériaux est généralement réalisé en faisant traverser l’objectif par la lumière incidente. L’objectif sert donc en même temps de condenseur. On utilise à cet effet une lame semi-transparente ou un prisme à réflexion totale. Les modes d’éclairage par réflexion en fond clair et fond noir sont aussi disponibles. La figure 9 montre en coupe schématique un descriptif d’éclairage par réflexion en fond noir et en fond clair pour objets opaques. De très nombreuses applications se développent dans le domaine de l’inspection et le contrôle de qualité des semiconducteurs assemblés sur les puces électroniques. Ces circuits électroniques intégrés sont généralement observés par ces modes d’éclairage par réflexion en fond clair et en fond noir à l’aide d’objectif spéciaux à immersion à eau (d’indice n = 1,33) afin d’améliorer la résolution sans endommager irréversiblement l’objet (fig. 9).

La surface de l’échantillon métallique, par exemple, peut être polie comme un miroir, puis légèrement attaquée par un réactif convenable, tel l’acide picrique, qui, agissant plus ou moins sur les différents éléments, produit des effets de corrosion visibles au microscope métallographique.

Microscopes polarisants

L’emploi de lumière polarisée (cf. LUMIÈRE Polarisation) apporte souvent en microscopie des compléments d’information très précieux. L’examen en microscopie d’échantillons entre polariseur et analyseur peut, grâce aux phénomènes d’interférences dits «relatifs», permettre d’identifier des microcristaux biréfringents uniaxes ou biaxes.

Très utilisé en cristallographie et aussi en pétrographie ^{[cf. PÉTROGRAPHIE]}, le microscope polarisant peut aussi rendre de grands services en biologie, car il fournit des renseignements importants sur l’état physique de la matière vivante.

Un microscope polarisant comporte, avant le condenseur, soit un prisme de calcite, soit une lame polarisante. L’analyseur constitué d’une façon analogue, est placé entre l’objectif et l’oculaire. Les orientations du polariseur, de l’analyseur et de la préparation sont en général réglables et repérables. Ces composants optiques à faces parallèles supplémentaires doivent être placés sur des trajets de lumière non focalisée, ce qui nécessite l’adjonction de lentilles supplémentaires et, en particulier, d’une lentille de tube qui reforme une image intermédiaire dans le microscope.

L’observation au microscope polarisant peut se faire aussi bien sur des préparations fixées que sur des préparations fraîches ou des cellules vivantes. Dans ce dernier cas, on peut étudier les variations de la biréfringence au cours de l’évolution de la cellule, par exemple dans la mitose (apparition du fuseau achromatique biréfringent).

Emploi des radiations invisibles

L’emploi de radiations invisibles («lumières invisibles») peut être avantageux pour l’étude de préparations présentant, en fonction de la longueur d’onde, une absorption très différente de celle qui a lieu en lumière visible. On utilise alors des systèmes optiques comportant des lentilles en silice, fluorine et/ou des miroirs. Les images sont photographiées dans le cas de l’ultraviolet ; elles sont transformées en images visibles par un convertisseur électronique ^{[cf. INFRAROUGE]} dans le cas de l’infrarouge. Par ailleurs, en plus de l’amélioration du contraste dans certaines préparations biologiques, le pouvoir séparateur du microscope est nettement amélioré grâce à l’emploi de lumières de courte longueur d’onde.

Microscopie par fluorescence

L’observation en fluorescence, originellement effectuée en lumière transmise grâce à un mode de fond noir, se pratique maintenant à l’aide d’un microscope de type classique dont la source lumineuse utilisée en mode de réflexion (épifluorescence) émet une quantité importante de radiations dans le vert, le bleu et le proche ultraviolet. Dans ce mode d’observation, l’échantillon fluorescent émet une lumière qui possède des propriétés spectrales différentes de la source d’excitation. La séparation optique de la lumière excitatrice de forte intensité et de la fluorescence émise de très faible intensité est assurée par des miroirs séparateurs (miroirs dichroïques) et des filtres qui séparent la lumière suivant sa longueur d’onde.

Dans la configuration dite d’épifluorescence, l’objectif est donc utilisé à la fois comme condenseur vis-à-vis de la source de lumière excitatrice et comme collecteur de lumière de fluorescence (fig. 10 a). Ce mode d’épifluorescence nécessite donc un puissant éclairage par réflexion associé à plusieurs combinaisons interchangeables de filtres de fluorescence permettant de renvoyer sélectivement la lumière d’excitation vers la préparation et de capter sélectivement la lumière de fluorescence émise par chaque type de composé fluorescent (fig. 10 a). On utilise généralement des lampes à vapeur de mercure sous pression; des filtres spéciaux placés à la sortie de la source lumineuse ne laissent pénétrer dans le microscope que les radiations dont la longueur d’onde varie entre 300 et 600 nm. Les substances fluorescentes généralement employées, telle que la rhodamine, la fluorescéine et les coumarines éclairées par cette lumière, émettent un rayonnement dont la longueur d’onde est supérieure à celle des rayons incidents (excitation de la fluorescence). Il suffit alors d’arrêter la lumière incidente avec un filtre, placé entre le miroir séparateur dichroïque et les oculaires, pour percevoir la lumière émise par l’échantillon fluorescent, qui devient source lumineuse.

Ce type d’observation, d’une grande sensibilité, est assimilable aux observations de fond noir et procure des images d’excellent contraste. La fluorescence de plusieurs marqueurs d’une même préparation peut être successivement et parfois simultanément observée en épifluorescence grâce à un changement de filtres ou grâce à des filtres à double excitation.

Il existe dans les préparations biologiques quelques substances, telles les porphyrines, la chlorophylle, qui sont spontanément fluorescentes (fluorescence primaire). D’autres substances deviennent fluorescentes après certains traitements (cyclisation par les vapeurs d’aldéhyde formique). Mais le microscope à fluorescence est surtout utilisé pour mettre en évidence des colorants fluorescents (fluorochromes), qui se fixent sélectivement sur certaines structures tissulaires ou cellulaires (fluorescence secondaire).

Le principal intérêt de cette technique est le marquage de protéines avec des corps fluorescents. Ainsi, on peut marquer un anticorps avec un fluorochrome et traiter avec cet anticorps une préparation qui contient l’antigène protéique correspondant; dans ce cas, il se forme un complexe antigène-anticorps marqué (fig. 10 b). L’examen de la préparation au microscope à fluorescence permet de localiser l’anticorps marqué avec un fluorochrome (fig. 10 c), donc l’antigène correspondant qui a capté cet anticorps ^{[cf. IMMUNOLOGIE]}. Cette technique d’épifluorescence est très utilisée pour décrire l’architecture intracellulaire et tissulaire sur de très nombreuses préparations à des fins de recherches ou afin d’établir le diagnostic de nombreuses maladies bactériennes et surtout virales. Les résultats sont rapides et très sûrs. La microscopie de fluorescence est d’un grand intérêt pour la localisation d’un ou de plusieurs gènes sur des chromosomes par hybridation in situ de sondes d’acides nucléiques fluorescentes (fig. 11). La grande sensibilité, la possibilité d’utiliser des caméras ou des systèmes d’acquisition ultrasensibles (caméra C.C.D. refroidies) et la facilité d’opérer des mesures quantitatives rendent cette technique très attractive.

Microscopie confocale

La localisation fine de molécules dans les cellules et les tissus fait exclusivement appel aux méthodes d’immunocytochimie, ou, pour les acides nucléiques, à l’hybridation in situ. En microscopie de fluorescence classique, décrite ci-après, les techniques de marquage avec des fluorochromes sont parmi les plus intéressantes car elles combinent un haut rendement et une grande simplicité d’utilisation. De plus, la mise à disposition de fluorochromes spécifiquement sensibles à différents éléments du milieu intra-cellulaire (pH, concentration en Ca⁺⁺, Na⁺, etc.) a étendu l’utilisation de la microscopie en fluorescence à l’étude de la physiologie cellulaire. L’inconvénient majeur des sondes fluorescentes est une perte de résolution due à l’émission de fluorescence défocalisée qui se superpose à l’image du plan focal. Lorsqu’une haute résolution est nécessaire, la seule solution était alors de tenter de reproduire le marquage en microscopie électronique sur des cellules fixées ou coupées par cryo-ultramicrotomie.

La microscopie de fluorescence en mode confocale a permis de pallier ces inconvénients puisque son principe est de pratiquer des «coupes optiques virtuelles» dans l’objet observé et de n’enregistrer que l’image de la fluorescence émise dans un plan. De plus, le traitement informatique associé permet d’afficher des images provenant du signal enregistré par un détecteur ultrasensible, et de reconstituer la distribution tridimensionnelle de la fluorescence dans le visible. On obtient couramment dans ces conditions une résolution latérale de 0,3 猪m et résolution verticale de 0,5 猪m, y compris sur des objets de grande épaisseur (de 50 猪m et plus). Il est donc possible d’individualiser de très petites structures marquées – par exemple, des vésicules d’endocytose – et cela dans des cellules entières, des cultures organotypiques ou des couches épaisses de tissu.

Principe optique

Alors que le microscope photonique classique capte simultanément tous les points de l’objet, le microscope à balayage utilise une configuration optique dans laquelle la source est fortement focalisée sur un point qui peut être balayé. Dans le mode de détection confocale, mis au point par Marvin Minsky en 1957, le détecteur est simultanément focalisé sur ce même point (fig. 12). Le principe de cette nouvelle application repose sur la confocalisation extrême sur l’échantillon d’un faisceau laser d’excitation et du champ de l’objet perçu par le détecteur généralement constitué d’un photomultiplicateur de haute sensibilité, l’échantillon étant éclairé et interrogé point par point, et cela de façon successive grâce au mécanisme de balayage. Ce point joue le rôle de foyer excité et renvoie une lumière, réfléchie ou de fluorescence, selon le mode d’observation choisie, laquelle est d’abord captée, puis filtrée afin de s’assurer de sa nature (lumière de réflexion ou de fluorescence) avant d’être de nouveau focalisée sur un autre foyer situé devant le détecteur. On obtient ainsi une amélioration du contraste et une meilleure résolution avec une très faible profondeur de champ. L’association de la microscopie confocale au mode d’épifluorescence permet de mesurer point à point la quantité de fluorescence émise par une préparation et ainsi de réaliser une véritable imagerie microscopique à trois dimensions.

La résolution des images avoisine la taille minimale d’une tache de diffraction à trois dimensions, c’est-à-dire de l’ordre de 0,2 à 0,5 micromètre dans les plans perpendiculaires et axial du microscope dans le visible grâce à des objectifs à immersion de forte ouverture numérique.

Applications

Le microscope confocal permet de réaliser des coupes optiques verticales ou obliques, ce qui bouleverse les traditions et permet d’observer des échantillons beaucoup plus épais qu’auparavant. Les applications biomédicales sont nombreuses: étude de la morphogenèse de tissus ou d’embryons ou de la localisation de gènes multiples sur des fragments de chromosomes par hybridation in situ et étude immunocytochimique de multifluorescence sur des tissus ou sur des cellules isolées (fig. 13).

La microscopie confocale représente le développement le plus important de la microscopie optique à balayage laser au cours des dix dernières années. L’image de coupes optiques y est réalisée point par point, ce qui permet des projections tridimensionnelles d’objets biologiques marqués en fluorescence tels que des organismes en développement (fig. 14). Il s’agit d’une véritable technique de microtomographie tissulaire et cellulaire qui permet d’atteindre une résolution submicrométrique à trois dimensions. Les applications en science des matériaux sont, elles aussi, en pleine expansion. Citons l’inspection des surfaces non planes avec mesure de rugosité, de fracture des matériaux, l’examen de circuits intégrés, le contrôle de qualité de l’état de surface de tous types de matériaux (fig. 15).

Les avantages de la microscopie confocale sont donc:

– d’améliorer considérablement le pouvoir de résolution des marquages par fluorochromes, sur cellules ou tissu fixé et coupé. La résolution obtenue permet d’aborder certaines questions qui nécessitaient l’utilisation de la microscopie électronique. Cette dernière méthode, plus longue et de réalisation plus difficile, reste irremplaçable dès que l’on veut effectuer des observations ultrastructurales;

– d’abaisser le seuil de détection, puisqu’il devient possible de voir quelques molécules de fluorochrome ;

– d’offrir de nouvelles possibilités d’investigation, en science des matériaux et en biologie. On peut en effet travailler sur des cellules vivantes, des tranches de tissu frais et suivre facilement l’évolution de marqueurs ou de flux ioniques avec une résolution subcellulaire.

2. Microscopie électronique

Parmi les microscopes à radiations corpusculaires, seuls les microscopes électroniques sont très largement employés. Ils utilisent les propriétés ondulatoires des électrons accélérés auxquels peut être associée une longueur d’onde selon la relation de Louis de Broglie entre la longueur d’onde et la quantité de mouvement mv :

où h est la constante universelle de Planck égale à 6,62 憐 10 size=1^漣34 Js.

La longueur d’onde est d’autant plus courte que la vitesse des électrons, ou la tension sous laquelle ils sont accélérés, est plus grande. Pratiquement pour V ⁰= 200 kV, v = 0,695 c (où c est la vitesse de la lumière dans le vide) et = 2,5 pm (1 picomètre [pm] = 10 size=1^漣12 m), soit environ 100 fois plus faible qu’une distance moyenne interatomique dans un solide.

Le fait d’utiliser des électrons au lieu de photons impose cependant un certain nombre de contraintes, même s’ils sont relativement faciles à obtenir et à accélérer par un champ électrostatique. En raison de leur fort pouvoir d’interaction avec la matière, ils ne se propagent librement que dans une enceinte à vide. Pour les dévier ou les focaliser, l’optique adaptée fait appel à des lentilles électroniques où des champs électriques ou magnétiques de révolution modifient leurs trajectoires.

Pratiquement, ce sont les travaux d’une équipe de pionniers à Berlin (Gabor, Ruska, Busch, Knoll, von Borries), à la fin des années 1920, qui ont conduit à l’obtention des premières images de microscopie électronique à transmission par Ernst Ruska en 1931. Ce premier instrument présentait une architecture très semblable au microscope photonique avec une source de rayonnement, une optique d’éclairement, l’échantillon préparé sous forme d’une lame mince de quelques dizaines à quelques centaines de nanomètres d’épaisseur, une optique de formation de l’image sur un écran d’observation fluorescent sous l’impact des électrons (ou sur une émulsion photographique destinée à son enregistrement). L’élément optique le plus important est alors la lentille objectif située juste après l’échantillon et qui en donne une première image dont les lentilles qui suivent fournissent un agrandissement sur le détecteur.

Cette conception générale du microscope électronique s’est maintenue jusqu’à aujourd’hui à travers plusieurs générations d’instruments commerciaux (Philips, Zeiss, JEOL, Hitachi, Topcon) aux performances régulièrement améliorées, qui permettent d’obtenir des images par transmission de la structure atomique d’échantillons solides minces avec une résolution à l’échelle atomique.

En 1939, Manfred von Ardenne introduisait le premier microscope électronique à balayage dans lequel l’image est construite point par point par déplacement d’une très fine sonde d’électrons sur la surface de l’échantillon et par visualisation sur un tube cathodique d’un spot dont l’intensité est modulée par la grandeur d’un signal résultant de l’interaction entre la sonde et l’échantillon. Par comparaison avec la famille de microscopes conventionnels décrits ci-dessus, l’élément important d’optique électronique dans un microscope à balayage réside dans la lentille située avant l’échantillon, chargée d’assurer la focalisation du faisceau primaire en un spot très étroit dont la taille gouverne en grande partie le pouvoir de résolution. En outre, il n’existe pas dans ce type de microscopes de lentilles grandissantes après l’échantillon. L’image est tout à fait équivalente à une image de télévision, le grandissement entre l’information perçue sur l’écran d’observation étant reliée aux dimensions explorées sur l’échantillon par le rapport des amplitudes de déplacement de la sonde sur l’échantillon et du spot sur le moniteur TV. Mais ce n’est qu’après les travaux de Cosslett et Nixon à Cambridge en 1953 que ces microscopes à balayage sont devenus commercialisés, et ils constituent maintenant près des deux tiers du parc de microscopes électroniques en fonctionnement. Leur grande commodité d’utilisation, leur souplesse pour visualiser des champs d’extension très variable sur des échantillons massifs, l’étendue de leur profondeur de champ en font un outil indispensable dans l’exploration du monde microscopique, et les laboratoires industriels y font très souvent appel.

À côté de ces deux principales familles de microscopes électroniques (M.E.T.: microscope électronique à transmission, ou T.E.M. en anglais d’une part, et M.E.B.: microscope électronique à balayage en réflexion ou S.E.M. en anglais d’autre part), on doit signaler plusieurs types d’instruments plus ou moins mixtes ou intermédiaires qui ont considérablement élargi le champ d’application de la microscopie électronique. Le premier est le microscope à balayage en transmission, plus connu sous le sigle anglo-saxon S.T.E.M., qui résulte des travaux d’Albert Crewe et de ses collaborateurs à Chicago à la fin des années 1960. La société britannique Vacuum Generators le propose sur le marché depuis près de vingt ans. Il utilise une sonde primaire de taille subnanométrique d’électrons issus d’une source à effet de champ et qui est transmise à travers un échantillon mince afin de limiter l’élargissement du faisceau au cours de sa progression dans la matière. L’intérêt d’une telle approche est de pouvoir explorer sous différents aspects, définis par le jeu des détecteurs ou des spectromètres utilisés, les divers caractères structuraux, aussi bien que chimiques, de la lame mince, avec une résolution quasi atomique.

L’idée d’effectuer une analyse chimique conjointement à la visualisation de l’échantillon n’est en fait pas récente. En 1944, Hillier et Baker aux États-Unis proposaient, pour arriver à cette fin, d’étudier les pertes d’énergie subies par les électrons au cours de la traversée de l’échantillon. Mais ce n’est que bien plus tard, au cours des années 1960 et surtout 1970, que cette technique de spectroscopie des pertes d’énergie est devenue un outil analytique en microscopie électronique, à la suite des travaux de diverses équipes (en particulier celle de Raimond Castaing à Orsay) destinés à adapter un spectromètre performant sur une colonne de microscope. Aujourd’hui, ainsi qu’il l’a été démontré par l’équipe d’Orsay, cette voie constitue l’approche la plus performante en termes de nombre d’atomes identifiables (atome unique isolé sur un film support ultramince) et la plus riche par la diversité des informations recueillies (spécificité chimique, état de valence, symétrie du site cristallin).

Dans l’intervalle, c’est-à-dire entre 1950 et 1980, l’analyse chimique locale a principalement été réalisée par mesure de la longueur d’onde des rayons X émis par le solide soumis à l’impact du faisceau d’électrons primaires. Le prototype des instruments de ce type est la microsonde construite par Raimond Castaing en 1951 à l’O.N.E.R.A., dans laquelle un spectrographe classique à cristal analyse les photons X provenant d’une zone irradiée de l’ordre de quelques dixièmes de micromètres. L’instrument a ensuite été commercialisé par la société C.A.M.E.C.A., assurant ainsi une présence française dans ce domaine de l’instrumentation scientifique depuis une trentaine d’années. En parallèle, l’introduction des diodes semiconductrices pour mesurer l’énergie des photons X a sensiblement modifié le champ d’utilisation de cette technique. Sa compacité réduite et son implantation aisée au regard de l’échantillon dans une colonne de microscope électronique en ont fait un accessoire analytique très commode.

Finalement, ce panorama des microscopes ne serait pas complet sans une référence à la microscopie à émission ionique dont Erwin Müller (en Allemagne, puis aux États-Unis) a été l’initiateur et le responsable des perfectionnements successifs au cours de plusieurs décennies. Cet appareil, qui utilise l’ionisation par effet de champ d’atomes de gaz rare au voisinage des atomes de surface d’un échantillon préparé sous forme d’une pointe fine de quelques dizaines de nanomètres de diamètre, a produit dans les années 1960 les premières images, avec une résolution atomique, de la surface de matériaux réfractaires. Une dimension analytique a été introduite plus récemment en mesurant par spectrométrie à temps de vol la masse des ions évaporés à partir de cette surface sous l’influence de pulses de tension. Une performance a été réalisée au cours de l’année 1993 par une équipe de l’université de Rouen en reconstruisant, atome par atome, la distribution tridimensionnelle de la nature chimique de ces atomes dans un petit volume d’alliage métallique à l’extrémité d’une telle pointe.

Description des microscopes

Microscope conventionnel à transmission

La colonne d’un microscope électronique est formée d’un empilement, généralement vertical, d’éléments (fig. 16): le canon à électrons, les lentilles au milieu desquelles est placé l’échantillon, la chambre d’observation. Ces trois parties servent respectivement à produire et à accélérer les électrons, à les dévier et à les focaliser le long de trajectoires les amenant à traverser l’échantillon dans des conditions déterminées, et à les détecter. Dans tout l’espace où se meuvent les électrons règne le vide ou, plus exactement, une pression très faible, au moins inférieure à 10 size=1^漣5 torr (1 torr = 1 mm de mercure). La tendance actuelle est d’améliorer la qualité de ce vide aux alentours de 10 size=1^漣9 torr afin de préserver la propreté de la surface libre de l’échantillon.

La source d’électrons assume une double fonction, à savoir produire les électrons et les accélérer. L’émission des particules peut être obtenue de deux façons différentes.

Dans un canon de type classique, un filament en forme de V en tungstène ou un petit cristal pointu d’hexaborure de lanthane est chauffé par un courant électrique à une température de l’ordre de 1 900 à 3 000 ⁰C. Le filament est entouré d’un cylindre, appelé wehnelt ; en dessous se trouve l’anode, percée comme le wehnelt d’une ouverture pour laisser passer le faisceau électronique. La distance entre le wehnelt et l’anode est de l’ordre du centimètre. L’anode est à la masse, le filament est à la haute tension négative, par exemple 100 kV; le potentiel du wehnelt diffère de celui du filament de quelques centaines de volts. Il sert, comme la grille d’une triode, à régler l’intensité du faisceau électronique. Pour les microscopes à plus haute tension, jusqu’à 1 000 kV et même au-dessus, une succession d’électrodes portées à des tensions croissantes joue le rôle d’un petit accélérateur de particules.

Un second type de canon utilisé est le canon à émission de champ. Il ne nécessite aucun chauffage de l’émetteur d’électrons. Le filament est ici constitué d’un fil de tungstène en forme de pointe, dont le rayon de l’extrémité est de l’ordre de 10 size=1^漣7 m. Il est porté à un potentiel négatif de quelques kilovolts par rapport à une première anode extractrice: il en résulte un champ électrique très intense au voisinage de la pointe. Sous l’action de ce champ, les électrons sont arrachés de l’extrémité par effet tunnel. Ce canon présente une brillance plus grande que le canon classique permettant en particulier de concentrer un faisceau de l’ordre du nanoampère dans une sonde de l’ordre du nanomètre. En contrepartie, il est nécessaire d’assurer un très bon vide (10 size=1^漣11 torr) autour du filament.

Dans les deux cas, le faisceau accéléré comporte ou semble provenir d’une partie rétrécie, ou «cross-over», qui joue le rôle de source virtuelle d’électrons vis-à-vis de la colonne du microscope. Dans la succession de lentilles magnétiques qui constituent cette dernière, les électrons sont soumis à des forces de Lorentz tout au long de leurs trajectoires dans les champs magnétiques associés. Dans une description simplifiée, on peut représenter ces trajectoires au moyen de rayons comme dans le cas des lentilles minces de l’optique photonique.

Pratiquement, les lentilles magnétiques sont des électroaimants de révolution percés d’un canal axial à travers lequel passent les électrons. Elles sont donc formées d’un bobinage, d’une carcasse de fer doux et de pièces polaires. Le bobinage est constitué par un grand nombre de tours de fils de cuivre; il est parcouru par un courant destiné à créer un champ magnétique. Ce champ est concentré dans l’entrefer grâce à la carcasse et aux pièces polaires. Il agit sur les électrons en leur imprimant un mouvement spiral et focalisant le long de leur direction de propagation. Contrairement à l’optique photonique, il ne peut pas exister en optique électronique de lentilles divergentes. Mais leur propriété focalisante (ou leur distance focale) peut être modifiée continûment en faisant varier le courant parcourant le bobinage.

Les lentilles traversées successivement par les électrons sont: le condenseur, l’objectif, la lentille intermédiaire et le projecteur.

Le condenseur permet d’éclairer une partie plus ou moins grande de l’objet, c’est-à-dire soit en mode parallèle, soit en mode focalisé. Les microscopes possèdent maintenant trois ou quatre condenseurs afin d’offrir une large gamme de modes d’éclairement.

L’objectif est la lentille principale, car de ses propriétés dépendent les performances du microscope en termes de pouvoir de résolution. Il donne de l’objet un diagramme de diffraction dans son plan focal et une première image agrandie (fig. 17). Il a une courte distance focale f , par exemple de 1 à 3 mm; il agrandit quelques dizaines de fois. À l’intérieur de l’objectif, un porte-objet permet de déplacer l’objet étudié pour choisir la partie examinée. Ce porte-objet doit aussi souvent incliner l’objet par rapport au faisceau, pour pouvoir changer l’angle de visualisation et en effectuer ainsi une étude tridimensionnelle.

Les deux ou trois lentilles situées au-dessous de l’objectif (lentilles intermédiaires ou projecteurs) agrandissent le cliché de diffraction ou l’image, selon qu’elles conjuguent avec le plan d’observation le plan focal ou le plan image de l’objectif.

Traditionnellement, l’image ou le cliché de diffraction est visualisé sur l’écran fluorescent afin de réaliser la meilleure mise au point et enregistré photographiquement sur un film escamotable. De nos jours, la tendance est de compléter ces techniques classiques d’enregistrement au moyen de caméras de télévision de bas niveau de lumière pour améliorer les conditions fines de réglage du microscope à très haute résolution et fort grandissement. En outre, les nouvelles générations de caméras à réseaux de détecteurs semiconducteurs (C.C.D.) permettent un enregistrement numérique des données sur une large gamme d’intensités et constituent la voie privilégiée pour toutes les possibilités de traitement digital a posteriori.

Les échantillons destinés à être observés par transparence doivent être suffisamment minces pour que les électrons transmis y subissent un nombre réduit d’interactions, conservant ainsi un degré satisfaisant de collimation et de dispersion énergétique pour donner lieu à des images finales de bonne qualité. Il n’existe pas de critère simple de définition d’une épaisseur critique, celle-ci dépendant de l’information et de la résolution recherchées. On peut cependant admettre que cette épaisseur est de l’ordre de quelques dizaines à quelques centaines de nanomètres pour des électrons d’énergie primaire de 100 ou de 200 keV. Pour des électrons de plus haute énergie, la pénétration est accrue et on peut obtenir des images nettes avec des échantillons d’épaisseur typique de un micromètre. Cela a constitué un des grands succès des microscopes de 1 MeV et de 3 MeV construits à Toulouse sous l’impulsion de Gaston Dupouy dans les années 1960.

Pour obtenir ces échantillons minces, un grand nombre de techniques ont été élaborées, dépendant de la nature du matériau. Certaines, très élémentaires, consistent à le broyer en de très fines particules et à en recueillir des éclats sur des substrats spéciaux de carbone à trous. Pour les matériaux les plus résistants, toutes les possibilités d’amincissement chimique, électrolytique ou sous abrasion ionique sont aujourd’hui utilisées. On peut aussi faire croître des couches minces à partir de rien par dépôt en phase vapeur sur des substrats variés que l’on dissout ensuite dans des bains appropriés. Pour la matière plus molle des polymères ou du monde biologique, il existe un vaste arsenal de techniques de fixation chimique ou physique, d’enrobage, de découpe avec un appareil de microtomie. Il ne faut pas sous-estimer l’importance de cette étape de préparation de l’échantillon, même si elle prend parfois des allures de recette de cuisine, car c’est souvent de la qualité de l’échantillon observé que dépend le résultat de l’observation et de la mesure.

Microscope à balayage

Dans ce type de microscope, l’image est obtenue séquentiellement point par point en déplaçant la sonde d’électrons primaires sur la surface de l’échantillon. L’image est alors reconstruite en utilisant le signal généré par différents détecteurs pour moduler la brillance d’un tube cathodique. Un tel instrument possède donc un certain nombre de composants semblables à ceux du microscope décrit ci-dessus. Comme on peut le voir sur la figure 18, il s’agit du canon à électrons et de l’ensemble des lentilles destinées à focaliser le faisceau primaire en un spot ponctuel. Les meilleures performances sont obtenues lorsqu’on peut focaliser un courant intense dans une tache aussi petite que possible: les paramètres importants sont alors la brillance du faisceau primaire, que l’on accroît par utilisation d’une source à effet de champ, et les propriétés optiques de la dernière lentille focalisante.

Deux grandes familles de microscopes à balayage se distinguent par la nature de l’échantillon observé: les microscopes à réflexion (fig. 18 a), qui concernent les échantillons massifs et les microscopes à transmission (fig. 18 b), qui concernent les échantillons minces. Dans le premier cas, on recueille les signaux résultant de la cascade complexe de chocs à l’intérieur du spécimen entre les échantillons incidents et les atomes de la cible, et dont seule une faible fraction est réémise par la surface extérieure: électrons rétrodiffusés et électrons secondaires pour déterminer la topographie superficielle, rayons X pour l’analyse chimique d’un volume typiquement de l’ordre du micromètre cube. Les détecteurs placés en regard de l’échantillon doivent être adaptés à la spécificité de ces différents signaux, et une attention spéciale est portée à l’électronique de mise en forme.

Pour le microscope de type S.T.E.M., l’approche générale est similaire, mais les détecteurs privilégiés sont alors le détecteur annulaire, qui recueille les électrons diffusés à grand angle au cours de la traversée de l’échantillon, et le spectromètre de pertes d’énergie, qui mesure la distribution en vitesse des électrons transmis. Le volume générateur de ces signaux utiles peut alors être réduit à la taille minimale de la sonde et à une épaisseur très faible, ce qui fait de ce type d’instrument l’appareil le plus performant pour l’analyse ultime.

Applications en sciences physiques

Les perfectionnements apportés régulièrement au microscope électronique en ont fait un outil tout à fait indispensable dans notre exploration de la matière solide à l’échelle atomique et lui ont ouvert un large champ d’applications. En fait, tout objet inhomogène à l’échelle du nanomètre est concerné. Ce peut donc être une macromolécule, une interface entre deux milieux de natures différentes, un agrégat métallique, un défaut, un joint de grains, une dislocation dans un alliage métallique ou un composé semiconducteur, un empilement de feuillets sédimentaires, etc. Ce qu’il est aussi important de souligner, c’est que cette exploration ne consiste pas seulement à «voir», c’est-à-dire à déterminer la forme, l’arrangement atomique, la microstructure cristalline. Et c’est le rôle privilégié des images et des clichés de diffraction. Mais, de plus en plus, il s’agit aussi d’analyser la composition chimique, d’étudier les propriétés électroniques avec une résolution quasi similaire, de l’ordre du nanomètre ou mieux, et, dans cette voie, l’analyse X et la spectroscopie des pertes d’énergie jouent un rôle essentiel.

Pouvoir de résolution du microscope électronique

Pour illustrer cette richesse du champ d’applications, nous allons montrer d’abord comment le pouvoir de résolution du microscope électronique moderne est adapté à l’imagerie des structures atomiques.

Les qualités d’un microscope électronique dépendent surtout de celles de son objectif, car ce sont les défauts de l’image qu’il donne qui sont amplifiés par la lentille intermédiaire et le projecteur. Les défauts les plus importants ou, pour employer le vocabulaire usuel, les aberrations sont: l’aberration de diffraction, l’aberration de sphéricité, l’aberration chromatique et l’astigmatisme (cf. OPTIQUE Optique instrumentale).

Le phénomène de diffraction par une ouverture de taille finie intervient sur les ondes corpusculaires de façon identique à son action sur les ondes de lumière. Il fournit d’un point source objet une image, la tache d’Airy, dont le diamètre varie en/ 見, c’est-à-dire inversement proportionnellement à l’ouverture angulaire 見 de la lentille.

L’aberration de sphéricité (C ^S, exprimée en millimètre comme la distance focale f ) provient du fait que la lentille focalise davantage les rayons qui y pénètrent sous une inclinaison élevée. Elle fournit d’un point objet une image floue dont le diamètre varie comme la puissance cubique de l’ouverture 見. Par conséquent, elle oblige à diaphragmer énormément le faisceau qui y pénètre. Les lentilles électroniques sont beaucoup moins ouvertes que les lentilles de l’optique photonique. La raison en est qu’il n’existe pas en optique électronique de lentilles divergentes dont les défauts corrigeraient ceux, opposés, des lentilles convergentes.

Le rôle opposé de ces deux termes de diffraction et d’aberration de sphéricité en fonction de l’ouverture de la lentille objectif conduit donc à rechercher une ouverture optimale, conduisant à un compromis entre ces deux termes. Il lui correspond donc une résolution optimale qui est de l’ordre de 0,5 C ^S1/4 .^3/4 et qui correspond à une ouverture de l’ordre de quelques milliradians. Contrairement au cas où la résolution est limitée par la seule influence de la diffraction, son comportement est plus complexe. Pour améliorer la résolution, on a donc intérêt à diminuer la longueur d’onde des électrons et à réduire le coefficient d’aberration sphérique de l’objectif par un meilleur confinement du champ magnétique intense qui règne entre les pièces polaires. Ce qui conduit aux meilleures résolutions existant actuellement sur le marché, à savoir 0,19 nm à 200 kV avec C ^S = 0,4 mm, et 0,11 nm à 1 200 kV avec C ^S = 1,5 mm, c’est-à-dire des valeurs tout à fait suffisantes pour résoudre les distances interatomiques dans un cristal, tout en étant environ cent fois supérieures à la longueur d’onde.

L’aberration chromatique des lentilles est associée à la dispersion de largeur non nulle de leur distance focale pour une distribution non monochromatique des électrons. Pour la réduire, il est nécessaire de stabiliser, avec une précision de l’ordre de quelques millionièmes, aussi bien la tension accélératrice que le courant dans les lentilles, puisque la distance focale dépend de ces deux quantités.

Enfin, le terme d’astigmatisme n’est pas considéré comme un paramètre limitatif dans le pouvoir de résolution car les objectifs sont toujours munis de stigmateurs grâce auxquels on peut rétablir la symétrie de révolution du champ de l’objectif.

Comprendre les images et les clichés de diffraction

À cette fin, il faut comprendre comment les électrons tombant sur l’échantillon interagissent avec lui et comment l’information qu’ils transportent est ensuite recueillie par les détecteurs. Procédons par étapes: si nous envoyons un faisceau parallèle d’électrons sur un atome isolé, il y a diffusion du faisceau par l’atome, c’est-à-dire qu’après interaction les électrons voyagent dans toutes les directions de l’espace et que, dans une direction donnée, l’amplitude du faisceau dépend de l’angle de déflection et de la nature de l’élément cible. L’interaction prépondérante est de type électrostatique entre le potentiel local dû au noyau chargé positivement et les nuages électroniques des électrons qui l’entourent d’une part, et la charge négative de l’électron incident de haute énergie d’autre part.

Pour un échantillon amorphe, dans lequel il n’existe aucune relation stricte entre les positions des atomes du solide, si ce n’est peut-être une distance entre plus proches voisins assez bien définie, la distribution des électrons diffusés peut se décrire en première approximation comme pour un atome. Et l’intensité de l’onde diffusée dans une direction est égale à la somme des intensités diffusés par les atomes indépendamment.

Comme représenté schématiquement dans la figure 17, la lentille objectif permet d’observer dans son plan focal image la distribution des électrons en fonction de leur angle de diffusion. C’est ce qu’on appelle la figure de diffraction qui, dans le cas d’un amorphe, est une distribution isotrope d’intensité régulièrement décroissante en fonction de l’angle de diffusion. Dans ce plan, on peut introduire un diaphragme de contraste qui sélectionne une partie seulement de ces électrons diffusés. Si, ensuite, on forme une image avec les électrons transmis à travers ce diaphragme, on obtient des variations d’intensité associées à des variations d’épaisseur ou de composition chimique de l’échantillon, car la proportion des électrons diffusés hors de ce diaphragme dépend de ces deux paramètres.

Si, maintenant, la cible est un cristal parfait, donc formé de l’arrangement périodique d’atomes, il ne subsiste qu’un ensemble discret de directions de l’espace pour lesquelles l’intensité du faisceau diffusé est non nulle. Ce sont les directions de diffraction définies par les conditions de la loi de Bragg ^{[cf. CRISTAUX - Cristallographie]}. Il s’agit d’un phénomène d’interférences de nature ondulatoire. Dans ce cas, le cliché de diffraction est constitué d’un ensemble de taches bien définies. Les symétries de la figure ainsi observée et les distances interréticulaires mesurées constituent des atouts précieux pour identifier la structure cristalline.

Pour réaliser des images significatives à partir de ce cliché de diffraction, le choix de la taille et de la position du diaphragme de contraste dans le plan focal est alors essentiel. Ou bien on sélectionne les échantillons transmis dans l’axe (image en champ clair), ou bien uniquement ceux diffractés suivant une direction donnée, autour de la tache G¹ par exemple (image en champ sombre). Ces images mettent clairement en évidence les zones de l’échantillon qui diffèrent du cristal parfait. Cette technique permet donc de visualiser immédiatement tous les défauts de structure, comme les joints de grains, les interfaces, les défauts d’empilement, les dislocations. Ce fut un des grands succès de la microscopie électronique que de fournir en 1956 (Hirsch, Howie et Whelan à Cambridge) les premières images directes de dislocations dans un métal ou un alliage.

Enfin, si on sélectionne simultanément le faisceau transmis et le (ou les) faisceau(x) diffracté(s), on obtient une image d’interférences directement représentative de la structure cristalline (fig. 19). Cependant, son interprétation n’est pas immédiate, car la lentille, non parfaite comme déjà souligné, peut distordre l’information et l’éliminer même complétement pour les distances inférieures au pouvoir de résolution. On dit qu’il se comporte comme un outil de transfert de l’information, dont il faut maîtriser les caractéristiques pour comprendre complètement l’image enregistrée. Pour ne prendre qu’un exemple, les conditions de focalisation de la lentille objectif doivent être très bien connues pour déterminer si ce sont les points blancs ou les points noirs sur l’image qui correspondent à la position réelle des colonnes atomiques.

Avec les microscopes modernes de 200 à 400 kV, il est possible de résoudre au moins une distance interréticulaire dans la quasi-totalité des matériaux cristallisés. La course aux très hautes tensions (supérieures à 1 000 kV) se justifie encore, malgré le coût particulièrement élevé de ces machines, par un pouvoir de résolution permettant de visualiser les alignements de colonnes atomiques sous plusieurs orientations. Quand on dispose d’un porte-objet permettant d’incliner l’échantillon dans le microscope, il est alors possible intrinséquement de reconstruire la structure atomique du solide près d’un défaut en trois dimensions.

L’association de techniques spectroscopiques à ces capacités de visualisation à très haute résolution constitue enfin la perspective la plus stimulante. Il est désormais possible de voir la structure d’un nano-objet (objet dont la taille est de l’ordre de quelques nanomètres et qui, par ses dimensions très réduites, présente des propriétés quantiques originales de conductibilité, optiques, magnétiques, etc.) et d’analyser sa composition chimique, voire ses propriétés électroniques avec le pouvoir de résolution adapté. C’est vrai aussi pour tous les défauts de structure ou d’empilements dont la cristallographie et la chimie à l’échelle atomique conditionnent bien souvent les propriétés macroscopiques du solide.

Par la qualité de ses performances et la diversité des informations qu’elle procure sur la matière à l’échelle atomique, la microscopie électronique constitue encore aujourd’hui un outil de premier choix. Toutes les classes de matériaux peuvent ainsi être observées et analysées. On doit enfin souligner les perspectives très prometteuses offertes par les techniques in situ qui consistent à utiliser cette enceinte d’observation et d’analyse ultramicroscopique pour y effectuer des expériences variées: évolution en fonction de la température au voisinage d’une transition de phase, effets induits par irradiation sous les électrons du faisceau eux-mêmes mais aussi sous un faisceau externe d’ions, ou de photons, application de contraintes mécaniques externes pour étudier la dynamique de processus de déformations. Ce ne sont là que quelques exemples destinés à montrer la richesse des possibilités offertes.

Applications en biologie

L’outil perfectionné par les physiciens a beaucoup apporté à la biologie. Les espoirs de voir les cellules vivantes se sont évanouis avec les difficultés rencontrées, mais les progrès des techniques d’observation, et surtout leur diversification, ont permis d’accéder au matériel biologique à des niveaux très différents: des tissus aux macromolécules isolées.

«Voir» l’ultrastructure des tissus et des cellules

L’observation des tissus ou des cellules en culture a bénéficié des progrès des méthodes de fixation et d’inclusion qui permettent la réalisation en routine de coupes fines (0,1 猪m) dans différents types de résines, éventuellement hydrosolubles, qui sont choisies en fonction de ce qu’on cherche à voir dans les objets inclus. Des cellules ayant subi divers traitements, ou sur lesquelles bourgeonnent des virus (fig. 20) sont aisément étudiées par l’observation de telles coupes. La fixation par le froid (congélation rapide des tissus par l’hélium ou azote liquide suivie d’une fixation chimique) permet une excellente préservation des organites cellulaires (fig. 21). De nouvelles méthodes se développent actuellement, qui utilisent la congélation sous haute pression, ou la fixation chimique rapide assistée d’un traitement par des micro-ondes, similaires à celles qui sont utilisées pour la cuisson des aliments. Les biologistes utilisent ce type de préparation pour la détection d’antigène (immuno-cytochimie), ou de certaines séquences dans les acides nucléiques, avec des sondes complémentaires de ces séquences (hybridation in situ). Le développement de la biologie moléculaire permet de fabriquer une variété infinie d’anticorps monoclonaux et de fragments d’ADN synthétiques, qui permettent une localisation très fine des constituants cellulaires. Ces anticorps et sondes moléculaires sont rendus visibles sur les coupes soit à l’aide de marqueurs le plus souvent constitués de billes d’or colloïdal (de 1 à 40 nm) fixées sur les molécules d’anticorps (IgG) ou sur les sondes d’ADN marquées à la biotine, soit par la méthode d’autoradiographie qui permet de localiser les sites où une sonde d’ADN radioactive s’est fixée dans les cellules. La cryo-ultramicrotomie permet de réaliser des coupes de tissus congelés dans lesquels les constituants cellulaires sont particulièrement bien accessibles, du fait de l’absence de résine d’inclusion.

Ces techniques de froid apportent une autre dimension aux observations: il est possible de fracturer sous vide un tissu congelé et de lyophiliser une partie de l’eau contenue dans les couches superficielles. Cette surface décapée plus ou moins profondément est rendue visible par métallisation, fournissant une vision très claire des organites cellulaires, les répliques ainsi faites pouvant être observées en microscopie par transmission ou en microscopie à balayage à haute résolution.

Les méthodes analytiques utilisant la spectrométrie X et la perte d’énergie des électrons sont également utilisées en biologie, et permettent la localisation et la quantification d’accumulations locales dans des cellules d’atomes d’origine physiologique comme le calcium, ou d’origine externe, tels que des dépôts de métaux toxiques dans le poumon.

«Voir» les molécules

Des progrès considérables ont été apportés par la microscopie électronique dans la visualisation des macromolécules isolées. Parmi celles-ci, les acides nucléiques, les protéines et certains polysaccharides ont fait l’objet de très nombreuses études. Il est important de bien comprendre que la microscopie électronique ne remplacera jamais les méthodes biophysiques d’analyse structurale des molécules que sont la cristallographie par les rayons X et la résonance magnétique nucléaire (R.M.N.), méthodes qui fournissent des cartes structurales des molécules avec des résolutions de quelques dixièmes de nanomètres. Ces méthodes nécessitent l’obtention de cristaux diffractant les rayons X pour la première, et des molécules de poids moléculaire inférieur à 20 000 daltons pour la R.M.N. Dans les deux cas, des protéines très pures et très concentrées (plusieurs mg/ml) sont nécessaires. La microscopie électronique bénéficie de la possibilité unique de voir les molécules individuellement, donc de pouvoir utiliser les méthodes statistiques d’étude des populations.

Les techniques utilisées pour fixer les molécules sur un support et les contraster dépendent des molécules à observer. Les protéines assez grosses pour être directement visibles (d’une taille supérieure à 5 nm, ou ayant une forme caractéristique) peuvent être enrobées d’un film de sels de métal lourd, uranium ou tungstène, qui fournira le contraste. Cette méthode, dite de coloration négative , est plus résolutive que la décoration par métallisation (aussi appelée ombrage ) qui, pour être valable, doit être réalisée sur des protéines lyophilisées. Les molécules comme l’ADN peuvent être «colorées» par des métaux lourds et observées en fond noir. L’ombrage fournit également d’excellents résultats pour visualiser les molécules filamenteuses (acides nucléiques et polysaccharides).

Observation des protéines

La structure de nombreuses protéines a pu être déterminée à partir d’images de coloration négative. Les molécules sont vues individuellement, et des traitements statistiques permettent de les aligner, de réaliser des «moyennages» d’images à partir desquelles des reconstructions tridimentionnelles peuvent être faites si l’on dispose d’images inclinées. Ces méthodes de tomographie ont permis d’obtenir des images en trois dimensions de nombreuses protéines et d’autres particules biologiques comme des virus. Ces résultats peuvent remplacer – ou être complémentaires de – ceux qui sont obtenus avec la cristallographie ou la R.M.N., méthodes qui ne sont pas utilisables avec toutes les macromolécules biologiques. Une autre approche, complémentaire de la coloration négative, consiste à observer des molécules flottant dans un film de glace amorphe, obtenu par congélation ultrarapide d’un film d’eau très mince (de 50 à 100 nm environ) contenant les molécules. L’absence de support permet d’obtenir des molécules orientées de façon libre, et l’absence de produit contrastant d’éviter des artefacts.

Une étape complémentaire consiste à réaliser des cristaux en deux dimensions, qui peuvent être observés en coloration négative, ou même dans la glace comme pour les molécules isolées. Un traitement informatique des images peut être fait sur les zones qui présentent un bon arrangement des protéines (fig. 22), ce qui permet de réaliser des reconstructions tridimentionnelles de la protéine. La diffraction des électrons, qui peut être obtenue avec certains cristaux de protéines, a conduit à des analyses cristallographiques qui rejoignent en résolution les résultats de la cristallographie avec les rayons X.

Observation des acides nucléiques

Les molécules d’acides nucléiques, et tout particulièrement l’ADN double chaîne, sont visibles en microscopie électronique à condition de les étaler et de les déposer sur les supports compatibles avec l’observation au microscope. Traditionnellement, l’étalement s’obtient en mélangeant l’ADN avec le cytochrome c, protéine qui se complexe à l’ADN et forme un film très fin à la surface de l’eau. Ce film récupéré sur un support en carbone mince (de 3 à 10 nm) est ensuite contrasté par ombrage. Une méthode plus résolutive consiste à adsorber les molécules à partir de leur solution, sur un film de carbone déposé sur un treillis, et à les contraster par une imprégnation par un sel d’uranium. Un bon contraste est obtenu par l’observation de ces préparations en fond noir. Le contour des molécules peut être suivi aisément, et des informations topologiques (forme supertorsadée des molécules circulaires, par exemple) peuvent être obtenues. Un suivi de contour des filaments permet de mesurer des paramètres comme la courbure locale, qui peut être corrélée à la séquence de l’ADN étudié. Ces paramètres sont très utiles à connaître pour étudier les interactions entre les molécules d’ADN et des protéines qui interviennent dans sa compaction, telles que les histones qui forment les nucléosomes, ou des protéines responsables de la régulation de l’expression des gènes. Une technique plus délicate dans sa pratique consiste à observer les molécules d’ADN flottant dans un mince film de glace. Cela permet, à l’aide de vues stéréoscopiques, de déterminer la conformation réelle des molécules telle qu’elle était dans la solution aqueuse d’origine.

Toutes ces méthodes d’observation des molécules d’ADN – seules ou en association avec des protéines ou des ligands variés, telles que des drogues antitumorales – sont complémentaires des méthodes traditionnelles de la biochimie. Leur utilisation conjointe est de plus en plus utilisée de nos jours.

Les techniques d’observation de l’ADN double chaîne sont valables pour l’étude de l’ADN simple chaîne et de l’ARN, qui présente souvent des segments simple et double chaîne. Elles sont plus délicates d’emploi, mais permettent d’aborder des problèmes difficiles comme l’étude de la structure du génome de virus à ARN comme le VIH.

3. Microscopies de champ proche

Les années 1980 ont vu la naissance et le développement de la microscopie de champ proche, encore appelée microscopie à sonde locale , avec, notamment, les succès du microscope à effet tunnel et du microscope à force atomique. Avec ces nouveaux instruments, l’objet est analysé point par point par balayage d’une sonde locale, une pointe très effilée, placée à quelques distances atomiques de sa surface. L’image obtenue est une cartographie d’une grandeur physique caractéristique de l’objet sondé. Ces nouveaux microscopes sont caractérisés par l’absence d’une optique de transmission; ils échappent donc aux limitations inhérentes à ces composants optiques.

En configuration de champ proche, l’amplitude de la grandeur physique détectée décroît fortement quand la sonde s’éloigne de l’échantillon. Cela assure un excellent pouvoir de résolution à ce type de microscopie. En particulier, cela permet d’échapper au critère de Rayleigh, lié, lui, à la propagation, et de percevoir des détails de dimension bien inférieure à la longueur d’onde du rayonnement utilisé. L’image possède donc une très haute résolution, car la détection s’effectue très près du lieu d’émission, et c’est la taille utile de la sonde locale qui fixe la résolution. L’image peut ainsi révéler, selon l’interaction choisie, soit une topographie de la surface (fig. 23), soit une cartographie électronique, chimique, magnétique ou optique.

Microscopie par effet tunnel

C’est la réalisation, en 1982, d’une expérience, prévue dès la fin des années 1920 comme la conséquence de la mécanique quantique, qui est à l’origine du développement de ces nouvelles microscopies. Gerd Binnig et Heinrich Rohrer, deux chercheurs des laboratoires I.B.M. Zürich, observent une manifestation directe de l’effet tunnel: un courant d’électrons entre deux électrodes métalliques séparées de quelques nanomètres dans le vide. Ils mesurent la dépendance exponentielle du courant en fonction de la distance qui sépare les électrodes.

Un microscope à balayage (le microscope à effet tunnel) sera développé à la suite de ce succès. Son principe est fondé sur le contrôle d’un courant qui s’établit entre une fine pointe métallique (sonde locale) et la surface d’un échantillon (située à quelques distances atomiques) grâce à l’effet tunnel. C’est le démarrage d’une microscopie nouvelle pour l’étude de matériaux conducteurs ou semi-conducteurs. Son essor a été grandement facilité par les connaissances déjà acquises en physique des surfaces. En quelques années, ces nouvelles microscopies conduisent à une vision nouvelle des surfaces, dans l’espace réel, à l’échelle atomique, qui répond ainsi à la quête des physiciens, métallurgistes et chimistes, et suscite l’intérêt des biologistes. L’intense activité autour de cette nouvelle instrumentation est aussi liée aux applications possibles dans le domaine des nanotechnologies. Les inventeurs de cette nouvelle microscopie, G. Binnig et H. Rohrer, ont reçu en 1986 le prix Nobel de physique.

Principe, réalisation et fonctionnement du microscope

L’effet tunnel est une conséquence de la dualité onde-corpuscule. Il se manifeste lorsqu’une particule doit traverser une région de l’espace, appelée barrière de potentiel, où son énergie totale est inférieure à son énergie potentielle. La traversée par effet tunnel de cette région, interdite au sens de la mécanique classique, est possible si la fonction d’onde associée à la particule s’étend sur des dimensions comparables à celles de la barrière à franchir.

Dans le cas du microscope fondé sur ce principe, la barrière est l’espace vide (de quelques dixièmes de nanomètre) qui existe entre l’échantillon conducteur et une pointe métallique. L’effet tunnel se traduit alors par le passage d’un courant I qui dépend exponentiellement de la distance de la pointe à la surface lorsqu’on applique une tension V (différence de potentiel) entre les deux électrodes.

L’interaction de champ proche est ici le couplage par effet tunnel entre la pointe sonde métallique et la surface d’un échantillon conducteur. Le courant résulte de ce couplage. L’image est obtenue en enregistrant le mouvement de cette pointe sonde lorsqu’on impose un courant constant lors du balayage de la surface. C’est le mode d’imagerie le plus pratiqué. Le mouvement ainsi contrôlé de la pointe lors du balayage permet d’accéder aux propriétés topographiques ou électroniques locales de la surface.

La réalisation d’un microscope à effet tunnel (fig. 24) suppose les éléments suivants:

– un dispositif d’approche contrôlée de la pointe à l’échantillon (une distance de quelques centimètres jusqu’à des fractions de nanomètre);

– un dispositif de balayage sans contact ou frottement de la pointe le long de la surface;

– un système antivibratoire qui permette de filtrer et d’amortir les vibrations parasites de l’environnement ambiant (dans la plupart des laboratoires, les vibrations du sol, par exemple, ont une amplitude de dix mille à cent mille fois plus élevées que la distance à contrôler);

– une électronique d’acquisition et de contrôle qui assure l’asservissement du mouvement de la pointe;

– un dispositif de stockage et de traitement des images.

L’image et son interprétation

Dans le mode de balayage usuel, dit à courant constant, c’est un dispositif d’asservissement qui assure une valeur constante au courant I lors du mouvement de la pointe. Dans ces conditions, l’image obtenue, qui représente la surface balayée, matérialise le mouvement z (x, y ) de la pointe pendant un balayage à courant I constant (contrôlé par une électronique d’asservissement). Pour obtenir z (x , y ), on utilise la linéarité des transducteurs piézo-électriques dont les déplacements sont proportionnels aux tensions de commande. On enregistre la tension V ^z , de commande du déplacement z , en fonction des tensions V ^x et V ^y qui assurent le mouvement de balayage. Des logiciels de présentation et de traitement d’images assurent diverses représentations du relief V ^z (V ^x ,V ^y ). Par exemple, on peut obtenir une vue de dessus en tons de gris où l’altitude V ^z est codée par une intensité lumineuse. Les protubérances apparaissent alors en clair et les creux en noir. L’interprétation de l’image dépend bien sûr du modèle d’interaction et de ses paramètres. Un modèle qui traduit de façon très simplifiée la réalité expérimentale permet d’accéder, d’une part, à la relation entre le courant I et le paramètre de couplage qu’est la distance s (pointe-échantillon) et, d’autre part, à une interprétation immédiate de l’image obtenue. Pointe et échantillon y sont considérés comme deux électrodes métalliques planes entre lesquelles une tension V est appliquée. Dans cette approximation, le courant I prend alors la forme suivante:

I = aV exp(face=F0019 漣 ks ),

où a est une constante et k dépend de la nature des électrodes. Une variation de 0,1 nm de la distance interélectrodes s se traduit par un changement d’un ordre de grandeur de I. C’est cette grande dépendance du courant en fonction de la tension qui donne la résolution exceptionnelle de ce microscope. L’image, interprétée selon ce modèle simple, représente le relief de la surface, puisque «à courant constant» signifie que la distance entre la pointe et la surface est constante. La finesse des détails peut être appréciée à l’échelle atomique, et cette capacité «de voir les atomes» (fig. 25) est à l’origine du succès du microscope à effet tunnel.

Si, dans cette interprétation, l’image représente la topographie de surface de l’échantillon, des modèles plus adaptés à la géométrie de l’expérience montrent que les électrons qui franchissent la barrière tunnel sondent de façon très fine la densité électronique locale de la surface de l’échantillon en fonction de leur énergie, c’est-à-dire en fonction de la tension appliquée V entre la pointe et l’échantillon. Cela explique la variété et la richesse des images de microscopie par effet tunnel obtenues à différentes tensions V . Elles révèlent des propriétés électroniques locales caractéristiques de la nature des atomes de surface; elles permettent donc une identification spectroscopique de ces atomes (fig. 25). Potentiellement, on a donc une sonde chimique de surface à très haute résolution.

On peut retenir des approches théoriques les résultats suivants.

Dans un régime de tensions V faibles, c’est-à-dire pour des énergies (eV) d’électrons, qui franchissent la barrière, faibles par rapport à l’énergie thermique kT , la pointe suit, à courant constant, un profil d’isodensité d’états électroniques à l’énergie du niveau de Fermi de la surface.

Le cas des tensions plus élevées a été traité par Norton Lang dont les travaux font apparaître deux conclusions essentielles:

– le mouvement de la pointe à courant constant suit pratiquement un profil d’isodensité d’états électroniques à l’énergie de Fermi de l’échantillon (E^F), ou à l’énergie de Fermi 梁eV suivant que la pointe est polarisée positivement ou négativement par rapport à l’échantillon;

– la valeur à la tension V ⁰ d’acquisition de la conductivité logarithmique différentielle (dI /dV ) (V /I) reflète la densité locale des états électroniques de surface à l’énergie E^F 漣 V ⁰. Ce résultat très important est à la base du développement des techniques spectroscopiques.

Dans tous ces modèles, le courant tunnel dépend exponentiellement de la distance entre la pointe et l’échantillon, et une régulation à 10 p. 100 du courant suffit alors pour obtenir une résolution verticale de 10 picomètres sur la topographie. De surcroît, comme le courant varie de plus d’un ordre de grandeur sur une distance interatomique, c’est par l’atome à l’apex de la pointe que passe la grande majorité du courant. Cela confère au microscope à effet tunnel une résolution latérale de l’ordre du dixième de nanomètre.

Spectroscopie à effet tunnel

Puisque la microscopie par effet tunnel permet de sonder les densités d’états électroniques, des méthodes spectroscopiques qui permettent d’accéder à la répartition en énergie des états électroniques en un point de la surface ont été développées. Pour mettre en œuvre ces techniques, il suffit de contrôler la fenêtre d’énergie des électrons qui contribue au courant tunnel, c’est-à-dire la tension tunnel V , et d’analyser la dépendance du courant en fonction de la tension. Pour cela, deux méthodes ont été mises en jeu: la spectroscopie à courant constant et la spectroscopie à distance constante .

On peut réaliser une spectroscopie à courant constant de deux façons: soit localement en un point de la surface et en l’absence de balayage, soit en faisant l’image de la densité d’états électroniques à une tension V ⁰ choisie. Dans le premier cas, pour un courant de régulation I donné, on étudie la dépendance de la conductivité différentielle dI /dV en fonction de la tension par des procédés de modulation classiques de la tension V . Cette analyse permet de repérer éventuellement les énergies auxquelles apparaissent des pics de la densité d’états électroniques. On peut alors, ayant repéré ces énergies, donc les tensions caractéristiques V ⁰, faire ensuite des images conventionnelles (par balayage); on révèle ainsi la localisation des sites caractéristiques de cette structure de la densité d’états électroniques. Son utilisation s’est avérée riche d’enseignements (fig. 26). Les images à différentes tensions sondent cependant la densité électronique à des distances différentes.

La spectroscopie à distance constante , moins utilisée, permet aussi l’acquisition des caractéristiques locales entre le courant et la tension I (V ) et d’images spectroscopiques qui traduisent les variations spatiales de la densité électronique à différentes tensions pour une même distance entre la pointe et l’échantillon. Dans ce cas, en chaque point du balayage, la boucle d’asservissement ne met en œuvre qu’une fraction du temps pour l’acquisition du pixel de l’image conventionnelle à courant constant et à tension V ⁰ fixée. Le reste du temps, la boucle n’agit pas, la distance entre la pointe et la surface est ainsi maintenue constante, tandis qu’on acquiert les couples (I ⁱ, V ⁱ) de la courbe I (V ) locale en ce point de la surface.

Les potentialités de ces nouvelles microscopies ont été largement exploitées en physicochimie locale pour les surfaces des métaux ou des semi-conducteurs. À partir d’images obtenues avec ces microscopes, on peut procéder à des analyses quantitatives et étudier la ségrégation de dopants (bore) en surface.

Pointes et microscopies d’émission

La pointe sonde est un élément essentiel du microscope à effet tunnel, et l’expérience des microscopies d’émission a servi à en maîtriser la préparation et à comprendre ses propriétés. Les microscopies d’émission sont de remarquables applications du pouvoir des pointes métalliques à concentrer les lignes de champ électrique à leur extrémité (apex) et à révéler de fortes variations locales du champ électrique à l’échelle atomique. Le champ électrique intense à l’apex d’une pointe métallique placée dans le vide et polarisée négativement provoque l’émission d’électrons du métal vers le vide. Le diagramme d’émission électronique est obtenu par projection des électrons sur un écran fluorescent ou sur des détecteurs à intensification d’image (galette de microcanaux). Il révèle la densité des plans atomiques à l’extrémité de la pointe. L’invention de ce microscope par Erwin Müller en 1930 a permis de tester la théorie de la loi d’émission et la distribution en énergie des électrons.

L’effet de champ peut également conduire à l’ionisation d’un atome neutre situé au voisinage d’une pointe métallique portée à un potentiel positif et placée dans une atmosphère où règne une faible pression d’hélium. L’ion formé est accéléré par les lignes de champ et frappe le détecteur en créant une image agrandie de la région où s’est produite l’ionisation. Le grandissement sur l’image obtenue est tel que c’est avec ce microscope que l’on a pu «voir les atomes» pour la première fois en 1950. La figure 27 montre la configuration des dernières couches atomiques à l’apex d’une pointe de tungstène. Bien que réservé à des échantillons de taille restreinte, ce type de microscopie ionique de champ a permis des études en vidéo-microscopie de processus physicochimiques tels que des mouvements d’atomes, des croissances de terrasses atomiques, des mesures de diffusion. Il a permis la mise au point de sources d’électrons de grande brillance, de faible divergence et de grande cohérence, et la réalisation d’une microscopie de projection avec mise en évidence d’hologrammes d’électrons. Les apports de la microscopie ionique de champ que nous venons d’évoquer ont été essentiels pour comprendre les propriétés des pointes et le rôle qu’elles pouvaient jouer dans la qualité et la résolution des images de microscopie par effet tunnel. Des modes de préparation de pointe, fiables et reproductibles ont été mis au point grâce aux techniques relevant de la microscopie électronique ou ionique de champ. On peut ainsi préparer des pointes stables et suffisamment fines pour assurer une excellente résolution dans les images (fig. 27).

Écriture-lecture à l’échelle atomique

L’un des attraits de la microscopie par effet tunnel réside dans la possibilité de marquage et de relecture à l’échelle atomique. Un des procédés consiste à fixer des atomes d’un gaz à l’apex de la pointe et de les déposer en un endroit voulu de la surface de façon à réaliser un motif. Ce sont des impulsions de tension de polarisation et d’amplitude adéquate qui permettent la fixation ou la libération d’un atome. Afin de diminuer la mobilité des atomes en surface, ce procédé est pratiqué à basse température. Un autre procédé de gravure de surfaces des semi-conducteurs consiste à décomposer des molécules d’une vapeur présentes dans une enceinte à l’aide du champ électrique intense qui règne à l’apex de la pointe et au voisinage d’un substrat. Les parties volatiles de la molécule sont libérées dans l’atmosphère, et un des composants de la molécule, par exemple un atome métallique, réagit avec la surface de l’échantillon, laissant ainsi une empreinte locale. De telles empreintes peuvent être réalisées à température ambiante. Leur durée de vie est fonction du type de substrat utilisé.

Le principal verrou technologique pour l’écriture-lecture à l’échelle nanométrique n’est pas lié à la faisabilité, mais, d’une part, à la difficulté de se repérer à de telles échelles (repérage du motif) et, d’autre part, à la lenteur des vitesses d’exécution qui rendent le procédé encore inexploitable pour des applications industrielles.

Le microscope à force atomique et la microscopie de force

Le premier microscope dérivé du microscope à effet tunnel est le microscope à force atomique (1985). Celui-ci utilise l’effet de proximité de la pointe et de l’échantillon et non le contrôle du courant tunnel. Ce type de microscopie peut donc permettre l’analyse de tous les matériaux, même ceux qui ne sont pas conducteurs. C’est par une pointe installée à l’extrémité d’un levier très sensible que l’on obtient une cartographie de haute résolution des forces qui s’exercent entre les atomes à l’apex de la pointe et ceux de la surface. On réalise ainsi une profilométrie à l’échelle nanométrique. Le levier sert à amplifier le mouvement de la pointe, et l’on enregistre optiquement ses déplacements verticaux lors du balayage.

L’avantage de cette instrumentation, fondée sur une cartographie de forces entre atomes, est d’ouvrir l’analyse pour tous les types de matériaux et d’accéder à la mesure locale de forces magnétiques ou électrostatiques. Elle permet en outre des caractérisations à l’air ou en atmosphère contrôlée.

Le microscope à force atomique est analogue à un profilomètre très performant qui donne accès à des mesures précises de la rugosité d’une surface à des échelles allant de la centaine de micromètres jusqu’au nanomètre. Ces possibilités remarquables sont déjà exploitées dans des programmes de caractérisation de surfaces d’échantillons à vocation technologique, dans les domaines de l’optique et de la micro-électronique.

Plus généralement, toutes les sondes locales dérivées du microscope à effet tunnel fonctionnent dans des régimes d’interaction où la distance entre la sonde et la surface est minimisée de façon à obtenir la meilleure résolution possible. Ce sont des microscopes de champ proche . Ils permettent d’étudier les variations locales d’une propriété ou d’un paramètre physique à la surface d’un échantillon. Ainsi, le microscope à force magnétique permet d’étudier et d’imager des propriétés magnétiques d’un échantillon en utilisant une pointe-sonde magnétique (cobalt ou nickel). Il a été développé pour analyser finement des matériaux magnétiques tels que les têtes et les supports d’enregistrement magnétique.

L’apparition d’une nouvelle technique ou la naissance d’un nouvel outil d’observation ont souvent permis des progrès significatifs dans la compréhension de processus biologiques. Dans ce contexte, l’intérêt des biologistes pour les microscopies de champ proche est lié aux nombreux avantages et potentialités de ces nouvelles méthodes de caractérisation. La très haute résolution et les possibilités d’identification spectroscopique sont certainement d’importants facteurs. Mais la possibilité d’observer les échantillons dans des conditions proches de celles in vivo a séduit les biologistes. L’utilisation de cette nouvelle microscopie en biologie se développe. On a déjà réalisé, avec le microscope à effet tunnel et avec le microscope à force atomique, des observations de molécules biologiques telles que celles des figures 28 et 29.

Les interactions fortes, qui peuvent exister entre la sonde et l’objet, nécessitent un apprentissage des conditions d’utilisation, des courants très faibles (de l’ordre du pico-ampère) en microscopie par effet tunnel et un mode d’imagerie évitant le contact en microscopie à force atomique.

Le champ proche optique

La microscopie optique de champ proche est une illustration de la possibilité d’atteindre des résolutions meilleures que celles qui sont imposées par le critère de Rayleigh. Celui-ci limite à/2 la résolution théorique d’un microscope traditionnel en utilisant des radiations de longueur d’onde. Cependant, ce critère, qui est une formulation des relations d’incertitude de Heisenberg, s’applique à la détection d’ondes progressives. Dans la configuration de champ proche où l’on détecte une onde évanescente, on échappe à cette restriction; des microscopes qui permettent d’obtenir des images d’objets tests avec des résolutions de l’ordre de quelques dizaines de nanomètres ont donc été mis au point. Mais l’interprétation de telles images pose un problème fondamental de résolution des équations de Maxwell dans une géométrie bien définie, et nécessite aussi une connaissance de la forme des objets. À cet égard, le couplage d’un microscope de champ proche optique avec des microscopes donnant la topographie de l’échantillon (microscope à effet tunnel, par exemple) permet de mieux cerner la relation entre les propriétés structurales et les propriétés optiques.

Si les débuts des microscopies à champ proche ont été marqués par des images spectaculaires et riches en informations, malgré la relative simplicité des premiers instruments, il faut remarquer que la maîtrise acquise en quelques années autorise dans certains cas des études fines de processus physico-chimiques avec analyse quantitative. Ces nouvelles microscopies prennent déjà le relais de méthodes classiques de mesure de rugosité de surface, à des échelles jusque-là inaccessibles avec les méthodes usuelles. De telles applications à la métrologie fine des surfaces sont d’une importance capitale.

• 1836; de microscope

n. f. Observation à l'aide du microscope.

— Technique de l'emploi du microscope.

⇒MICROSCOPIE, subst. fém.

Ensemble des techniques et procédés nécessaires pour effectuer une observation au microscope; cet examen lui-même. La microscopie en lumière polarisée est utilisée par W. J. Schmidt et ses élèves (1924) dans l'examen des cellules et des tissus animaux (Hist. gén. sc., t. 3, vol. 2, 1964, p. 662). Une autre forme nouvelle de microscopie est celle que l'on nomme microscopie interférentielle et qui dérive des recherches de Frederichs, Merton, Dyson, etc. (Hist. gén. sc., t. 3, vol. 2, 1964 p. 212). La microscopie électronique révèle la présence de fins filaments (...) qui ne sont pas continus, mais dont l'association pourrait constituer une neurofibrille (HUSSON, GRAF, Biol. gén., 1965, p. 51).

— P. méton. Résultat de cette observation. P. anal. C'est de la peinture aimable, divertissante à contempler par les jours de pluie et de neige. M. Boldini est plus curieux. Celui-là a des microscopies à la Meissonnier, et des agilités de pinceau à la Fortuny (HUYSMANS, Art mod., 1883, p. 65).

Prononc. :[]. Étymol. et Hist. 1832 (RAYMOND). Dér. de microscope; suff. -ie.

microscopie [mikʀɔskɔpi] n. f.

ÉTYM. 1836; de microscope.

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♦ Didact. Technique de l'observation au microscope. || Microscopie électronique. || Microscopie par émission électronique de champ, par ionisation de champ. || Microscopie X, par rayons X.